单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备
原理这个方案主要用于制备大量 M13 噬菌体的双链 DNA，因在实验室中 M13 噬菌体经常被用作克隆载体，以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬菌体 DNA
原理
这个方案主要用于制备大量 M13 噬菌体的双链 DNA，因在实验室中 M13 噬菌体经常被用作克隆载体，以及在某些特殊用途时需要制备大量的单链噬菌体 DNA，如当一个特定的重组体被多次用于制备反射性标记探针或构建大量定点突变体时。
材料与仪器
大肠杆菌 F' 菌株 M13 噬菌体原液
乙醇 NaCl 酚 氯仿 聚乙二醇 乙酸钠 STE TE Tris-HCl
琼脂糖凝胶 LB 或 YT 培养基 Sorvall GSA 转头或相同的转头 Sorvall SS-34 转头或相同的转头 Corex 离心管 硅橡皮圈 无菌试管
乙醇 NaCl 酚 氯仿 聚乙二醇 乙酸钠 STE TE Tris-HCl
琼脂糖凝胶 LB 或 YT 培养基 Sorvall GSA 转头或相同的转头 Sorvall SS-34 转头或相同的转头 Corex 离心管 硅橡皮圈 无菌试管
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
乙醇
NaCl （固体）
酚
酚：氯仿（1：1，V/V)
聚乙二醇（20%，m/V，PEG 8000) 溶于水。
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）
STE
TE ( pH 8.0)
Tris-HCl ( 10 mmol/L, pH 8.0)
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（1.2%) 悬于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 培养基
5 mmol/L MgCl2 的 LB 或 YT 培养基
4. 离心机和转头
Sorvall GSA 转头或相同的转头
Sorvall SS-34 转头或相同的转头
5. 专用设备
Corex 离心管（30 ml)
硅橡皮圈
无菌试管（13 mm x 100 mm 或 17 mm x 100 mm)
6. 载体和菌株
大肠杆菌 F' 菌株（从用适当宿主菌新划线分离的 M9 基本琼脂平板上挑去一个单菌落，接种至一个含 5 ml LB 的 20 ml 的无菌培养试管。温和振荡 37℃ 培养 24~36 h，不要使菌生长至稳定期，否则会增加 F' 质粒编码的菌毛丢失的危险。M13 噬菌体的单链 DNA 如果是用于作为寡核苷酸介导的突变，则其应在含 dut 和 ung 基因突变的大肠杆菌中增殖。）
M13 噬菌体原液
二、方法
M13 噬菌体 RF DNA 制备
1. 将 2.5 ml 铺板菌液转移至无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm）。加 0.5 ml M13 噬菌体原液（约 5 X 1011 pfu)，轻拍试管壁混合，室温放置 5 min。
2. 将感染细胞用装在 2 L 摇瓶中的 250 ml 预热至 37℃ 的含 5 mmol/L MgCl2 的 LB 或 YT 培养基稀释。37℃ 持续振荡培养 5 h。
3. 4℃ 4000 g ( Sorvall GSA 转头为 5000 r/min) 离心 15 min 收集感染细胞。回收上清可用于按以下步骤 7~17 的方法大规模制备 M13 噬菌体的单链 DNA。
4. 细菌沉淀用 100 ml 冰冷的 STE 重悬，4℃ 4000 g (Sorvall GSA 转头为 5000 r/min) 离心 15 min 回收洗后的细胞。
5. 用碱裂解的方法分离噬菌体闭合环状 RF DNA。适当增大裂解液的体积。纯化 DNA 可用 PEG 沉淀或层析柱纯化或 CsCI 梯度离心。
6. 用分光光度法测定 DNA 浓度，并用凝胶电泳法确定其完整性。将闭合环状 DNA 分成小份 -20℃ 冻存。
250 ml 感染细胞的 RF DNA 的产量为约 200 μg。
M13 噬菌体单链 DNA 制备
7. 从感染细胞培养液中的噬菌体颗粒中分离单链 DNA, 将步骤 3 的上清转移至一加有磁搅拌子的 500 ml 烧杯。
8. 上清中加入 10 g PEG 和 7.5 g NaCl, 室温搅拌 30~60 min。
9. 4℃ 10000 g ( Sorvall GSA 转头为 7800 r/min) 离心 20 min 收集沉淀，倒置离心瓶 2~3 min, 使上清流净，用 Kimwipes 纸巾吸去瓶壁和颈上残留的上清。
10. 瓶中加入 10 ml 10 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 8.0)，搅动瓶中溶液，并用巴斯德吸管充分冲洗瓶壁，当噬菌体沉淀溶解后，将溶液移至 30 ml Corex 离心管中。
11. 在噬菌体悬液中加入等体积的酚，用硅橡胶塞塞紧后剧烈振荡 2 min, 混匀内容物。
12. 室温以 3000 g ( Sorvallss-34 转头用 5000 r/min) 离心 5 min, 上层水相转移至一个新管，再用 10 ml 酚: 氯仿抽提。
13. 将等量的水相转移至两个 30 ml Corex 离心管中，各加入 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 0.5 ml 和乙醇 11 ml。充分混合后室温放置 15 min。
14. 4℃ 12000 g（Sorvall SS-34 转头为 10000 r/min）离心 20 min 回收单链 DNA 沉淀， 小心移去上清。
15. 每个管中加入 30 ml 4℃ 70% 乙醇，4℃ 12000 g ( Sorvall SS-34 转头为 10000 r/ min) 离心 10 min, 小心尽可能移去上清，倒置离心管使沉淀中的残液流尽，用 Kimwipes 纸巾吸干管颈处。
16. 室温放置，使残余乙醇蒸发，用 1 ml TE ( pH 8.0) 溶解沉淀，-20℃ 贮存。
17. 用分光光度法测定 DNA 浓度，并用琼脂糖电泳法确定其完整性，将闭合环状 DNA 分成小份（10~50 μg) -20℃ 贮存。
1. 缓冲液和溶液
乙醇
NaCl （固体）
酚
酚：氯仿（1：1，V/V)
聚乙二醇（20%，m/V，PEG 8000) 溶于水。
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2）
STE
TE ( pH 8.0)
Tris-HCl ( 10 mmol/L, pH 8.0)
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（1.2%) 悬于 0.5 X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 培养基
5 mmol/L MgCl2 的 LB 或 YT 培养基
4. 离心机和转头
Sorvall GSA 转头或相同的转头
Sorvall SS-34 转头或相同的转头
5. 专用设备
Corex 离心管（30 ml)
硅橡皮圈
无菌试管（13 mm x 100 mm 或 17 mm x 100 mm)
6. 载体和菌株
大肠杆菌 F' 菌株（从用适当宿主菌新划线分离的 M9 基本琼脂平板上挑去一个单菌落，接种至一个含 5 ml LB 的 20 ml 的无菌培养试管。温和振荡 37℃ 培养 24~36 h，不要使菌生长至稳定期，否则会增加 F' 质粒编码的菌毛丢失的危险。M13 噬菌体的单链 DNA 如果是用于作为寡核苷酸介导的突变，则其应在含 dut 和 ung 基因突变的大肠杆菌中增殖。）
M13 噬菌体原液
二、方法
M13 噬菌体 RF DNA 制备
1. 将 2.5 ml 铺板菌液转移至无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm）。加 0.5 ml M13 噬菌体原液（约 5 X 1011 pfu)，轻拍试管壁混合，室温放置 5 min。
2. 将感染细胞用装在 2 L 摇瓶中的 250 ml 预热至 37℃ 的含 5 mmol/L MgCl2 的 LB 或 YT 培养基稀释。37℃ 持续振荡培养 5 h。
3. 4℃ 4000 g ( Sorvall GSA 转头为 5000 r/min) 离心 15 min 收集感染细胞。回收上清可用于按以下步骤 7~17 的方法大规模制备 M13 噬菌体的单链 DNA。
4. 细菌沉淀用 100 ml 冰冷的 STE 重悬，4℃ 4000 g (Sorvall GSA 转头为 5000 r/min) 离心 15 min 回收洗后的细胞。
5. 用碱裂解的方法分离噬菌体闭合环状 RF DNA。适当增大裂解液的体积。纯化 DNA 可用 PEG 沉淀或层析柱纯化或 CsCI 梯度离心。
6. 用分光光度法测定 DNA 浓度，并用凝胶电泳法确定其完整性。将闭合环状 DNA 分成小份 -20℃ 冻存。
250 ml 感染细胞的 RF DNA 的产量为约 200 μg。
M13 噬菌体单链 DNA 制备
7. 从感染细胞培养液中的噬菌体颗粒中分离单链 DNA, 将步骤 3 的上清转移至一加有磁搅拌子的 500 ml 烧杯。
8. 上清中加入 10 g PEG 和 7.5 g NaCl, 室温搅拌 30~60 min。
9. 4℃ 10000 g ( Sorvall GSA 转头为 7800 r/min) 离心 20 min 收集沉淀，倒置离心瓶 2~3 min, 使上清流净，用 Kimwipes 纸巾吸去瓶壁和颈上残留的上清。
10. 瓶中加入 10 ml 10 mmol/L 的 Tris-HCl ( pH 8.0)，搅动瓶中溶液，并用巴斯德吸管充分冲洗瓶壁，当噬菌体沉淀溶解后，将溶液移至 30 ml Corex 离心管中。
11. 在噬菌体悬液中加入等体积的酚，用硅橡胶塞塞紧后剧烈振荡 2 min, 混匀内容物。
12. 室温以 3000 g ( Sorvallss-34 转头用 5000 r/min) 离心 5 min, 上层水相转移至一个新管，再用 10 ml 酚: 氯仿抽提。
13. 将等量的水相转移至两个 30 ml Corex 离心管中，各加入 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 ) 0.5 ml 和乙醇 11 ml。充分混合后室温放置 15 min。
14. 4℃ 12000 g（Sorvall SS-34 转头为 10000 r/min）离心 20 min 回收单链 DNA 沉淀， 小心移去上清。
15. 每个管中加入 30 ml 4℃ 70% 乙醇，4℃ 12000 g ( Sorvall SS-34 转头为 10000 r/ min) 离心 10 min, 小心尽可能移去上清，倒置离心管使沉淀中的残液流尽，用 Kimwipes 纸巾吸干管颈处。
16. 室温放置，使残余乙醇蒸发，用 1 ml TE ( pH 8.0) 溶解沉淀，-20℃ 贮存。
17. 用分光光度法测定 DNA 浓度，并用琼脂糖电泳法确定其完整性，将闭合环状 DNA 分成小份（10~50 μg) -20℃ 贮存。
相关文章
