用于基因组文库中的真核DNA的部分酶切（预反应）实验

不管高分子质量 DNA 的碱基组成与序列如何，通过水压机械剪切（hydrodynamic shearing) 均可将其以半随机形式片段化。但是，用这种方法制备的 DNA 需进行一系列酶反应操作（末端修复、甲基化、接头连接、接头消化）以保护内部限制位点，以及产生一些黏性末端。

限制性内切核酸酶 基因组 DNA λ 噬菌体 DNA 质粒寡聚体
蔗糖凝胶上样缓冲液 Tris-Cl
琼脂糖凝胶 毛细管 透析袋 水浴 宽口移液尖头

一、材料

1. 缓冲液和溶液

蔗糖凝胶上样缓冲液

Tris-Cl (10 mmol/L, pH 8.0)

2. 酶和缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶（0.6%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

琼脂糖凝胶，用于脉冲场凝胶电泳

4. 核酸和寡核苷酸

基因组 DNA，高分子质量

λ 噬菌体 DNA 和质粒寡聚体

5. 专用设备

毛细管，封口

透析袋，煮过

预置于 70℃ 的水浴

宽口移液尖头

二、方法

1. 利用将被用于制备克隆片段的同一份基因组 DNA 建立预实验。

(1) 将 30 μg 高分子质量真核 DNA 用 10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 稀释至 900 μl，加入 100 μl 适当的 10X 限制酶缓冲液。

(2) 用一个封口的玻璃毛细管将溶液轻轻混匀，确保高分子质量 DNA 已完全均匀地分布于限制酶缓冲液中。

(3) 混匀后，将稀释 DNA 于室温放置 1 h，使残余的 DNA 聚集块能彻底地解散。

2. 用 1 至 10 标记微量离心管。用一宽口的玻璃毛细管或一次性塑料移液器尖头将 60 μl DNA 溶液转移至一微量离心管中（第 1 管 )。转移 30 μl DNA 溶液至其他标记的 9 个微量离心管中。冰浴放置。

3. 加 2 单位适当的限制酶至第 1 管中。

4. 用一新鲜的移液尖头将第 1 管中 30 μl 反应液转移至系列离心管的第 2 管内。如前所述混匀，继续转移至下一个离心管中。在第 10 管中不加任何东西（无酶对照），同时从第 9 管中取出 30 μl 舍弃。

5. 37℃ 温育 1 h。

6. 70℃ 加热 15 min，使酶失活。

7. 将反应冷却至室温，加入适当量的蔗糖凝胶上样缓冲液。

8. 用宽口塑料移液尖头或一次性玻璃毛细管将溶液转移至 0.6% 琼脂糖凝胶的点样孔内，更好的是转移至脉冲场凝晈电泳的上样槽中，随后进行电泳。

9. 将消化的真核 DNA 大小与含 λ 噬菌体和质粒寡聚体的 DNA 标准进行比较。鉴别能获得大量理想大小基因组 DNA 的部分酶切条件。