λ噬菌体臂的纯化（通过蔗糖密度梯度离心）实验
原理与插入型载体不同，置换型载体的基因组含有中部的填充片段，为了容纳外源 DNA 片段，填充片段必须被去除。该过程一般被称为“λ 臂的制备”，包括用限制酶消化
原理
与插入型载体不同，置换型载体的基因组含有中部的填充片段，为了容纳外源 DNA 片段，填充片段必须被去除。该过程一般被称为“λ 臂的制备”，包括用限制酶消化 λDNA 使两臂与填充片段分开以及随后的臂的纯化。
材料与仪器
λ 噬菌体 DNA
EDTA 乙醇 正丁醇 乙酸钠 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE
琼脂糖凝胶 Beckman SW28 转子或相当型号 透析袋 皮下注射用针头 宽口吸头 蔗糖梯度 水浴
EDTA 乙醇 正丁醇 乙酸钠 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE
琼脂糖凝胶 Beckman SW28 转子或相当型号 透析袋 皮下注射用针头 宽口吸头 蔗糖梯度 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
MgCI2 (1 mol/L)
正丁醇
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.5% 和 0.7%），用 0.5XTBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
琼脂糖凝胶（0.5%，75 mm 厚），用 0.5XTBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体 DNA
4. 离心机和转子
Beckman SW28 转子或相当型号，用清亮离心管，25 x 89 mm ( 如 Beckman SW28 离心管或相当型号）
5. 专用设备
透析袋，煮过（用于 DNA 的透析袋）
皮下注射用针头（21号）
宽口吸头（large-bore tip)
蔗糖梯度（制备两种蔗糖溶液，一种含 10% 蔗糖，另一种含 40% 蔗糖，均溶于含 1 mol/L NaCl、20 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）、5 mol/L EDTA（pH 8.0）的缓冲液中。将这两种溶液均通过 0.22 μm 的硝酸纤维素膜以除菌。）
预置于 42℃ 和 68 ℃ 的水浴
二、方法
蔗糖梯度的制备
1. 在清亮的超速离心管中制备一个或多个 38 cm ( 10%~40%，m/V）蔗糖梯度，于 4℃ 静止 1~2 h 直到被使用（步骤 4)。
2. 消化和分析约 60 μg λ 噬菌体 DNA。用标准乙醇沉淀后，将 DNA 溶解于 TE（pH 7.6)，浓度为 150 μg/ml。取一 0.2 μg 的组分留作电泳对照 ( 步骤 7)。
3. 加入 1 mol/L MgCl2 至终浓度 10 mmol/L，42℃ 温育 1 h，使 λ 噬菌体 DNA 的黏性末端复性。然后，取 0.2 μg 的组分经 0.7% 琼脂糖电泳以测定复性是否成功。
4. 对经复性和消化作用的 λ 噬菌体 DNA 来说，它们在每个梯度中的上样量不要超过 75 μg，体积应为 500 μl 或更小。
5. 将梯度于 15℃、120000 g（26000 r/min 于 Beckman SW28 转子中）离心 24 h。
6. 通过用 21 号针头刺穿离心管底收集 0.5 ml 组分。
7. 从收集的样品中每隔两管取两份 15 μl 的样品，加入 35 μl 水。再加入 8 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液，其中一份 68℃ 加热 5 min，另一份则不处理。在一块比较厚的 0.5% 琼脂糖凝胶上分析所有样品，并用全长 λ 噬菌体 DNA 和步骤 2 中预留的消化 DNA 组分作分子质量标准。
8. 凝胶照相后，对含复性载体臂的组分进行定位并合并。
9. 将合并的样品置 1000 倍过量的 TE ( pH 8.0) 中，于 4℃ 透析 12~16 h，中间至少更换一次缓冲液。
10. 用正丁醇抽提透析样品数次，使样品体积降低至 3 ml 以下。
11. 用标准的乙醇沉淀回收透析 DNA。
12. 将 DNA 溶解于 TE ( pH 7.6)中，浓度为 300~500 μg/ml。
13. 用分光光度计测定 DNA 的浓度用 0.5% 琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。分装成 1~5 μg 的小份，-20℃ 保存。
1. 缓冲液和溶液
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
MgCI2 (1 mol/L)
正丁醇
乙酸钠（3 mol/L，pH 5.2)
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.5% 和 0.7%），用 0.5XTBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
琼脂糖凝胶（0.5%，75 mm 厚），用 0.5XTBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
3. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌体 DNA
4. 离心机和转子
Beckman SW28 转子或相当型号，用清亮离心管，25 x 89 mm ( 如 Beckman SW28 离心管或相当型号）
5. 专用设备
透析袋，煮过（用于 DNA 的透析袋）
皮下注射用针头（21号）
宽口吸头（large-bore tip)
蔗糖梯度（制备两种蔗糖溶液，一种含 10% 蔗糖，另一种含 40% 蔗糖，均溶于含 1 mol/L NaCl、20 mol/L Tris-Cl（pH 8.0）、5 mol/L EDTA（pH 8.0）的缓冲液中。将这两种溶液均通过 0.22 μm 的硝酸纤维素膜以除菌。）
预置于 42℃ 和 68 ℃ 的水浴
二、方法
蔗糖梯度的制备
1. 在清亮的超速离心管中制备一个或多个 38 cm ( 10%~40%，m/V）蔗糖梯度，于 4℃ 静止 1~2 h 直到被使用（步骤 4)。
2. 消化和分析约 60 μg λ 噬菌体 DNA。用标准乙醇沉淀后，将 DNA 溶解于 TE（pH 7.6)，浓度为 150 μg/ml。取一 0.2 μg 的组分留作电泳对照 ( 步骤 7)。
3. 加入 1 mol/L MgCl2 至终浓度 10 mmol/L，42℃ 温育 1 h，使 λ 噬菌体 DNA 的黏性末端复性。然后，取 0.2 μg 的组分经 0.7% 琼脂糖电泳以测定复性是否成功。
4. 对经复性和消化作用的 λ 噬菌体 DNA 来说，它们在每个梯度中的上样量不要超过 75 μg，体积应为 500 μl 或更小。
5. 将梯度于 15℃、120000 g（26000 r/min 于 Beckman SW28 转子中）离心 24 h。
6. 通过用 21 号针头刺穿离心管底收集 0.5 ml 组分。
7. 从收集的样品中每隔两管取两份 15 μl 的样品，加入 35 μl 水。再加入 8 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液，其中一份 68℃ 加热 5 min，另一份则不处理。在一块比较厚的 0.5% 琼脂糖凝胶上分析所有样品，并用全长 λ 噬菌体 DNA 和步骤 2 中预留的消化 DNA 组分作分子质量标准。
8. 凝胶照相后，对含复性载体臂的组分进行定位并合并。
9. 将合并的样品置 1000 倍过量的 TE ( pH 8.0) 中，于 4℃ 透析 12~16 h，中间至少更换一次缓冲液。
10. 用正丁醇抽提透析样品数次，使样品体积降低至 3 ml 以下。
11. 用标准的乙醇沉淀回收透析 DNA。
12. 将 DNA 溶解于 TE ( pH 7.6)中，浓度为 300~500 μg/ml。
13. 用分光光度计测定 DNA 的浓度用 0.5% 琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。分装成 1~5 μg 的小份，-20℃ 保存。
相关文章
