菌落的裂解和DNA与滤膜的结合实验

本方案介绍如何从携带重组质粒的克隆中释放出 DNA 并将其固定于硝酸纤维滤膜或尼龙膜的方法，这一方法最初由 Grunstein 和 Hogness 使用。

带有 E.coli 转化子克隆的滤膜
变性液 中和液 SDS (10% m V) 2X SSPE
玻璃或塑料托盘 微波炉 滤纸

一、材料

1. 缓冲液和溶剂

变性液，中和液，SDS (10%, m/V)，2X SSPE。

2. 专用设备

(1) 处理滤膜用的玻璃或塑料托盘。

餐馆用的托盘就很理想，一次可操作直径 9〜10 cm 大小的 25 张滤膜。

(2) 微波炉，真空烤干箱（可达 80℃）或紫外交联装置。

(3) Whatman 3 MM 滤纸。

3. 载体和菌种

带有 E.coli 转化子克隆的滤膜。

二、方法

1. 将 Whatman 3 MM 滤纸（或相当的滤纸）切成大小和形状适当的 4 张。使之适于 4 个玻璃或塑料托盘的底部，将 4 张 3 MM 滤纸分别浸泡在下列 4 种液体：
10% SDS，变性液，中和液，2X SSPE。

2. 倾去多余的液体，用一根 10 ml 移液管滚压滤纸，以除去滤纸与托盘底部间的气泡。

如滤纸太湿，溶解过程中细菌克隆将会肿胀和扩败，致使杂交信号摸糊和减弱，给以杂交信号为依据进行克隆鉴定的工作造成很大困难。

3. 用钝口镊子揭下琼脂板上的硝酸纤维膜或尼龙膜，菌落面向上置于 SDS 浸湿的 3 MM 滤纸上，3 min。

此项处理可防止变性和中和过程中质粒 DNA 的扩散，从而给出更加清晰的杂交信号。

4. 第一张滤膜在 SDS 溶液中浸泡 3 min 后，将其转到用变性液浸湿的第二张滤膜上，其余从琼脂板上揭下的滤膜也以同样次序进行转移，每张滤膜都要在变性液中浸泡 5 min。

在将滤膜从一个托盘移向另一个托盘时，用第一个托盘的边缘尽可能将滤膜上的水去掉，也可将滤膜先移至到纸巾上以去除多余水分。要避免让液体留在滤膜上带有细菌克隆的地方。

5. 将滤膜转到已经在中和液中浸泡的第三张 3 MM 滤纸上，并浸泡 5 min。

选用，重复此步骤一次。

6. 将滤再膜转到已经在 2X SSPE 液中浸泡的最后一张 3 MM 滤纸上，并浸泡 5 min。

我们宁愿用一定体积的 2X SSPE 液充满托盘或浴盆（如在杂交后洗膜时将要用到的），然后使来自步骤 5 的滤膜浮在液体表面数分钟，此后，在晃动容器的过程中让滤膜沉入液面以下并留在液体中，直到最后一张滤膜用同样方法处理完毕。这样做有两个目的：洗净滤膜的中和液，使滤膜带上 EDTA 以螯合二价阳离子（如 Mg2+），从而抑制任何残留的可降解 DNA 的核酸酶活性。

7. 用以下方法之一干燥滤膜：

如用烤干法固定 DNA：将滤膜置于干的 3 MM 滤纸上，菌落面向上，于室温至少 30 min。

如用紫外交联法固定 DNA：按销售商推荐方法，将滤膜置于已用 2X SSPE 液浸泡过或干的 3 MM 滤纸上。

8. 用以下方法之一固定 DNA 于滤膜上：

烤干法：用两张 3 MM 滤纸上下包夹滤膜，在真空烤箱内 80℃ 烤干 1~2 h 固定 DNA。

过度烤干会使滤膜变得很脆弱。尚未完全中和的硝酸纤维膜在烤干时会变为黄色或棕色，很容易破碎，也会使非特异杂交所形成的背景明显增强。

紫外交联法：用紫外交联装置按销售商推荐方法固定 DNA。

9. 用标记探针与固定在滤膜上的 DNA 进行杂交。

所有在杂交反应中不被马上使用的滤膜，都应加在 3 MM 滤纸中，并用铝箔包好于室温存放。