引物延伸分析（primer extension analysis）

引物延伸分析（primer extension analysis）主要用于mRNA 5′端作图。poly（A）+RNA首先与过量5′端标记的且与靶RNA互补的单链寡核苷酸引物杂交，然后用反转录酶延伸这个引物。产生的cDNA与RNA模板互补且长度与引物5′端和RNA 5′端之间的距离相等。该法在mRNA 5′端作图方面具有下述优势：一旦引物被子起始合成，延伸反应大多会进行到RNA模板的5′最末端，产物大小可精确测定。此外，产物长度不会受靶基因内含子分布与大小的影响。

几乎所有的引物延伸实验多采用长20~30 bp合成寡核苷酸引物。当用于和靶序列杂交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5′端150 bp以内时，可获得最佳结果。在更远距离处杂交的引物能增加异源延伸产物，因为反转录酶会在模板RNA的二级结构复杂区终止。因此，在设计引物时，除实际的序列之外还应考虑到杂交的位置。应尽可能使寡核苷酸的GC含量在50%左右且在3′端为G或C。用两个引物在mRNA相距一段已知距离（20~50 bp）的区域上分别杂交则更为理想。大小差别等于两个引物间距的延伸产物，可对结果进行验证。为了找到一对能产生明确延伸产物的引物，合成多个引物也许是必须的。

在很多情况下，引物延伸反应会产生两个产物：全长cDNA分子和短2~2 bp的反转录产物。这可能代表着多个转录起始位点导致的mRNA 5′端不均一性。有时，在临近靶mRNA 加帽位点的甲基化残基处的提前终止将产生更短的产物。与帽子结构相关的条带在不同mRNA 样品中的化学定量是不同的，对于一份给定样品总是一个定值。为了区分反转录假象和真正的mRNA 5′端不均一性，用5′端标记的探针进行S1核酸酶分析是一个很好的方法。

与未进一步分离的哺乳动物RNA相比，poly（A）+RNA样品可得到干净得多的结果，因为前者分产生多到不可接受的提前终止产物。通过在更高浓度（5 mmol/l）dNTP下进行延伸反应，并在用互补区位于mRNA 5′端50~100 bp以内的引物可将假象降至最低。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸引物一度是必须的。介这些年来，除非总是产生延伸产物的梯状条带，许多研究者已不再费心纯化了。

在杂交反应中，核苷酸引物分子的量应大约10倍于靶mRNA。更多量的引物可能会导致非特异延伸和人为条带的出现。所以，且一定量RNA与不同量的引物（通常为20~40 fmol，104~105 cpm）进行一系列预实验是可取的。

复性温度极大地影响引物延伸实验的质量，值得在预实验中调查以确定最佳复性温度。多数情况下，对于GC含量为50%，20~30 bp的引物，其最佳复性温度在40~60℃之间。可以设置一系列以5℃为间隔的引物延伸反应来确定最佳复性温度。

当用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析延伸产物时，大小已知、末端标记的DNA片段可用作相对分子质量标记参照物。但最好是采用与延伸反应相同引物的基于DNA模板的测序图，通过对照测序图读出引物延伸反应产物的大小，靶RNA的5′端可定位于一个特定的碱基。