电泳迁移实验 EMSA

1 .核蛋白的提取

①用 细 胞 刮子刮取RAW264.7 细胞与VSMC ，移入2.5mlEP 管中。

②将细胞用冰冷PBS 洗两遍，于4 ℃ , 5000g 离心3min ，沉淀细胞。

③加5 倍细胞体积的冰浴缓冲液A 洗细胞一次，于4 ℃ ,5000g 离心3 min 沉淀细胞.

④加3 倍细胞体积的冰浴缓冲液A 悬浮细胞，冰上放置30min 、剧烈振荡10 次，4 ℃ ,5000g 离心15min ，去上清，沉淀为细胞核。

⑤加与细胞等体积的冰浴缓冲液B ，充分混匀，冰上放置30min 后，于40 ℃ ,15 000g 离心15min, 上清为核蛋白。

⑥取2μl 核蛋白Bradford 法测定核蛋白浓度，分装后于-70 ℃ 保存。

2. 探针的标记与纯化

A 、探针的标记: 将以下试剂加入冰浴中的0.5m l 的EP 管中，总体积20 时。

①未标记的探针:2μl (50ng);

② 10 x 激酶缓冲液:2g 1;

③ [y-32P]ATP: 4μl (40 uCi);

④T4 多聚核甘酸激酶:lμl (10U);

⑤超纯水:11μl 。

B. 混匀后37 ℃ 水浴30 分钟;

C 、加入5μl 1%SDS/100 mM EDTA 短暂涡旋混匀，以终止激酶反应;

3 .探针的纯化

①准 备 MicroSpin' G25 分离柱;

②轻轻涡旋分离柱以重悬管内树脂;

③将盖子拧松1/4 后去掉管底密封;

④将分离管放入一只1.5mlEP 管中(EP 管作支撑用)

⑤ 735g 离心1分钟;

⑥加入样品:

⑦分离管放入一只新的1.5 mlEP 管中，缓慢将样品加入树脂床角度平面的中央，735g 离心1 分钟;

⑧将75μl 超纯水加入分离柱，735g 离心1 分钟;

⑨收集支撑管内纯化好的探针，小心丢弃分离管。

4.测定探针的放射活性

取1μl 纯化的探针，用闪烁计数器测量其放射活性，放射活性大于1* 10 5 cpm/μl 示标记成功。

5.凝胶迁移阻滞法测定NF-KB

A 、 按下 列 顺序分别将各反应成分加入第一套做好标记的EP 管内: ①结合缓冲液:4μl ②稳定液D:2 μl; ③核提取物:lug; ④去离子水至:16μl.

B 、用移液枪轻轻吸打混匀，40℃下将核提取物预孵育20 分钟，

C 、在核提取物预孵育期间，按下列顺序依次将各成分加入做好标记的第二套EP 管内: ①结合缓冲液:2μl; ②稳定液D:1μl; ③探针:1μl; ④去离子水:4μl 。

D 、将探针棍合物加入预孵育好的核提取物混合物中，用移液器轻轻吸打混匀后，4 ℃ 继续孵育20 分钟。

E、EMSA 测定: 预先将5% 非变性丙烯酞胺胶(38:2 ) 和电泳缓冲液(1X TGE) 预冷至4 ℃ , 然后: ①将每反应管内所有反应物加入样品孔中。同时在一空白孔中加入含溟酚蓝的上样缓冲液，以观测胶的移动情况。当溟酚蓝电泳至玻璃板下1/3 即可停止电泳( 约2 小时) 。②电泳:12.5V/cm(16cm 玻璃板为200V)。

F 、放射自显影: 电泳完毕后，取出凝胶，用保鲜膜封好; 将凝胶与放入有增感屏的曝光盒中，于-70 ℃ 放射自显影24 小时。然后将X 光片在显影液中显影30sec-1min ，在定影中定影15-30min ，清水冲洗干净后自然晾干。

G 、图像分析: 将各测量组的电泳 照片扫描至计算机，然后应用Bandscan 分析软件对电泳条带进行灰度测定，并计算平均光密度值(OD) ，以各条带的OD 值表示相应核转录因子的活性