在低熔点琼脂糖中连接质粒和目的DNA实验
原理质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，在以下的方案中（取自Struhl 1985)，质粒和外源
原理
质粒克隆操作最费时间的步骤是用电泳的方法对预期大小的外源 DNA 片段和质粒 DNA 片段进行纯化，在以下的方案中（取自Struhl 1985)，质粒和外源 DNA 的连接可在低熔点球脂糖存在的条件下完成。
材料与仪器
限制性内切核酸酶 外源 DNA 片段 质粒 DNA
Tris-Cl MgCl2 DTT ATP T4 噬菌体 DNA 连接酶
低熔点琼脂糖凝胶 恒温板 手提式长波紫外灯 水浴
Tris-Cl MgCl2 DTT ATP T4 噬菌体 DNA 连接酶
低熔点琼脂糖凝胶 恒温板 手提式长波紫外灯 水浴
步骤
一、材料
1. 酶和缓冲液
(1) 2X T4 噬菌体 DNA 连接酶反应混合物：
1 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 1.0 ul，100 mmol/L MgCl2 2.0 ul，200 mmol/L DTT 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H2O 4.5 ul，T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 Weiss 单位。
每个连接反应需 10 ul 体系。
每次应用前需新鲜配制，装于微量离心管中在冰中预冷，将反应混合物置于冰上备用。
(2) 限制性内切核酸酶
2. 凝胶
低熔点琼脂糖凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
外源 DNA 片段，质粒 DNA ( ~100 ug/ml，经去磷酸化处理）
每次连接反应大约需要 100 ng 去磷酸化的 DNA。
4. 专用设备
可设置 70℃ 的恒温板，手提式长波紫外灯（302nm），可设置 16℃ 的水浴。
二、方法
1. 建立一个酶切反应体系（不超过 20 ul），用适当的限制酶消化一定量的靶 DNA，要求最后能获得 250 ng 的目的片段。
2. 用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段。
3. 长波紫外灯下检査凝胶中 DNA 的电泳情况，根据条带的荧光强度估计 DNA 的量，用洁净的手术刀片切下目的条带，尽可能少切琼脂糖（一般约为 40~50 ul）。各目的条带都留下少许在凝胶中不要切，用于照相中表示各条带在凝胶电泳中的位置。
4. 将切下的凝胶片分别装入已做好标记的微量离心管中。
也可以将切下的凝胶片装在密封的微量离心管中于 4℃ 保存几天。
5. 离心管置于 70℃ 恒温块 15 min 以熔化凝胶条，确定离心管中凝胶的体积并计算含有约 200 ng DNA 所需的体积。
这样做的目的是用 10 ul 或更小的体积收取 200 ng 量的 DNA。这要取决于实际情况。对于含量低于 10 的条带（在凝胶中刚好可见)，连接仍可进行，尽管连接效率较低。
6. 预热一个无菌的微量离心管至 37℃ 立即加入下列成分：
去磷酸化质粒 DNA 60 fmol，外源 DNA 片段 120~240 fmol（不超过 10 ul 体积）。
用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。
在连接反应中，外源 DNA 片段与质粒载体的摩尔比一般在 2：1~4：1 之间。
7. 给每一个反应管相应地做两个对照，一个只加去磷酸化质粒载体，另一个只加外源 DNA 片段。
8. 上述的反应管置于 37℃ 温育 5~10 min，而后每管加入现冷的 10 ul 2X T4 噬菌体连接酶反应混合物。用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。16℃ 温育 12~16 h。
上述的连接产物可直接用于转化大肠杆菌或电泳。在做转化或电穿孔转化之前，装连接产物的微量离心管需预先于 70℃ 加热 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝胶。
习惯上，1~5 ul 连接产物可以用来转化化学方法制备的感受态细胞、而用更为有效的电穿孔转化法则只需 0.1~1.0 ul 的连接产物。采用更大体积进行电穿孔转化会增加溶质的浓度，以至使弧光的发生难以预测。
1. 酶和缓冲液
(1) 2X T4 噬菌体 DNA 连接酶反应混合物：
1 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 1.0 ul，100 mmol/L MgCl2 2.0 ul，200 mmol/L DTT 1.0 ul，10 mmol/L ATP 1.0 ul，H2O 4.5 ul，T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 Weiss 单位。
每个连接反应需 10 ul 体系。
每次应用前需新鲜配制，装于微量离心管中在冰中预冷，将反应混合物置于冰上备用。
(2) 限制性内切核酸酶
2. 凝胶
低熔点琼脂糖凝胶
3. 核酸和寡核苷酸
外源 DNA 片段，质粒 DNA ( ~100 ug/ml，经去磷酸化处理）
每次连接反应大约需要 100 ng 去磷酸化的 DNA。
4. 专用设备
可设置 70℃ 的恒温板，手提式长波紫外灯（302nm），可设置 16℃ 的水浴。
二、方法
1. 建立一个酶切反应体系（不超过 20 ul），用适当的限制酶消化一定量的靶 DNA，要求最后能获得 250 ng 的目的片段。
2. 用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段。
3. 长波紫外灯下检査凝胶中 DNA 的电泳情况，根据条带的荧光强度估计 DNA 的量，用洁净的手术刀片切下目的条带，尽可能少切琼脂糖（一般约为 40~50 ul）。各目的条带都留下少许在凝胶中不要切，用于照相中表示各条带在凝胶电泳中的位置。
4. 将切下的凝胶片分别装入已做好标记的微量离心管中。
也可以将切下的凝胶片装在密封的微量离心管中于 4℃ 保存几天。
5. 离心管置于 70℃ 恒温块 15 min 以熔化凝胶条，确定离心管中凝胶的体积并计算含有约 200 ng DNA 所需的体积。
这样做的目的是用 10 ul 或更小的体积收取 200 ng 量的 DNA。这要取决于实际情况。对于含量低于 10 的条带（在凝胶中刚好可见)，连接仍可进行，尽管连接效率较低。
6. 预热一个无菌的微量离心管至 37℃ 立即加入下列成分：
去磷酸化质粒 DNA 60 fmol，外源 DNA 片段 120~240 fmol（不超过 10 ul 体积）。
用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。
在连接反应中，外源 DNA 片段与质粒载体的摩尔比一般在 2：1~4：1 之间。
7. 给每一个反应管相应地做两个对照，一个只加去磷酸化质粒载体，另一个只加外源 DNA 片段。
8. 上述的反应管置于 37℃ 温育 5~10 min，而后每管加入现冷的 10 ul 2X T4 噬菌体连接酶反应混合物。用一个无菌一次性吸头快速混匀上述混合物，避免琼脂糖凝胶凝固。16℃ 温育 12~16 h。
上述的连接产物可直接用于转化大肠杆菌或电泳。在做转化或电穿孔转化之前，装连接产物的微量离心管需预先于 70℃ 加热 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝胶。
习惯上，1~5 ul 连接产物可以用来转化化学方法制备的感受态细胞、而用更为有效的电穿孔转化法则只需 0.1~1.0 ul 的连接产物。采用更大体积进行电穿孔转化会增加溶质的浓度，以至使弧光的发生难以预测。
注意事项
上述的连接产物可直接用于转化大肠杆菌或电泳。在做转化或电穿孔转化之前，装连接产物的微量离心管需预先于 70℃ 加热 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝胶。
常见问题
习惯上，1~5 μl 连接产物可以用来转化化学方法制备的感受态细胞、而用更为有效的电穿孔转化法则只需 0.1~1.0 μl 的连接产物。采用更大体积进行电穿孔转化会增加溶质的浓度，以至使弧光的发生难以预测。
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