免疫铁蛋白技术

第二节　免疫铁蛋白技术

一、基本原理

　　铁蛋白是一种含铁约占23%的蛋白质，分子量460kD,直径10～12μm。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能 试剂 结合为一种双分子复合物。此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，铁胶粒直径核心为55～60nm含2000～3000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。铁蛋白来自许多动物，以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高。因而，商品铁蛋白主要是从马脾脏中提取的。

二、铁蛋白的提取和纯化

取健康的马脾（新鲜或冰冻均可），去除脾外的淋巴结和脂肪组织，按湿重1：1.5或1：2加入蒸馏水，用组织匀浆器将组织匀浆，置水浴中加热至75～85℃，使铁蛋白以外的蛋白质变性，冷却后用2～4层纱布过滤，滤液离心取上清液，每100ml上清液中加入35g硫酸铵，充分搅拌使铁蛋白沉淀析出，4℃过夜，3000～10000r/min离心20min，弃去上清液，刮取沉淀物置透析袋内，剩余沉淀物以蒸馏水洗后，一并加入透析袋内对水透析，除去硫酸铵。100ml中加入4～5g硫酸镉使炎结晶，在室温或4℃冰箱内使之出现铁蛋白结晶。此铁蛋白结晶以2%硫酸铵（pH5.58）溶解后，如上述再用硫酸镉使之结晶。反复溶解，结晶六次，达到纯化。纯化后铁蛋白在半饱和的硫酸溶液内可保存1～2年。用时以蒸馏水透析除盐后即可应用，应用前可以用负染色法在电镜下观察，了解铁蛋白的完整性和纯度。

商品制备的铁蛋白是用2%硫酸铵溶液稀释的1%～2%溶液（pH5.85）。为了在应用中得到满意的结果，应用前必须将商品制备的铁蛋白进一步纯化。纯化的方法是用0.1n NaOH或0.1n HCl调整pH值至5.85，然后加入20%硫酸镉溶液使其在铁蛋白液中最终浓度为5%硫酸镉，此溶液置于4℃冰箱内2h（或过夜）至结晶完成，离心1h（2000r/min）充上清液。铁蛋白结晶再溶解，离心除去不溶性颗粒，倾出上清液，加入5%硫酸镉再结晶，至在显微镜下呈棕红色铁蛋白结晶为止。将结晶溶于2%硫酸铵溶液中，用50%5硫酸铵溶液沉淀三次，第三次沉淀形成的沉淀物溶于少量蒸馏水中，先对自来水透析，再对0.05mol/L,pH7.5磷酸缓冲透析12～24h。纯化的铁蛋白溶液用100000r/min 超速离心2h ，除去3/4无色上清液，沉淀物（内含铁蛋白）在4℃过夜，待完全融解后，用微孔滤过器（Millipore filter, 孔径 0.25～0.45μm）过滤，保存1～2年内仍可使用。

三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合

一般用低分子量的双功能试剂把两者联结起来，常用的双功能试剂有间苯二甲基二异氰酸盐（简写XC）。甲苯2，4二异氰酸盐（简写TC）。邻茴香胺（简写BDD）；对，二氟一间，间，二硝基二苯矾（简写FNPS）和戊二醛。近年来，普遍认为戊二醛作为联结剂效果较好，对抗体活性影响小，标记抗体产量高。分为一步法和二步法，现简介如下：

1．一步法 　　以15mg 铁蛋白和3mg球蛋白溶于0.9ml 0.1mol/L磷酸缓冲液中，pH7.0,加入0.1ml新鲜配制的戊二醛溶液，使其最终浓度为 0.005%～0.05%, 加入0.02%叠氮钠（NaN3）防腐，此混合液置37℃24h，无需搅拌，结合完毕后加0.01mol/L赖氨酸中止反应。

2．二步法

（1）在含50～80mg铁蛋白的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中，加入稀释的戊二醛，使其最终浓度为0.05%～0.15%，总体积为1ml。

（2）置37℃作用2h后，经葡聚糖G―25 滤柱，除去未结合的戊二醛。为避免不必要的稀释，只收集脱峰的中间部分。然后加入球蛋白（铁蛋白与球蛋白之比为5：1）即铁蛋白最终浓度为15mg/ml，球蛋白3mg/ml。

（3）混合液置37℃，作用12h（无需搅拌），加入0.01mol/L 的赖氨酸以中止进一步交联。两步反应都需在0.02% NaN2防腐条件下进行。

四、电镜标本的制备方法

1．固定 　同常规电镜一样，应用醛类和四氧化锇双固定，以维持细胞和组织的超微结构。有文献报告以4%的甲醛溶液在pH7.2的磷酸缓冲内，在0℃进行固定，并用四氧化锇作后固定，不会影响抗原的反应能力。高锰酸钾能使大部分抗原失去活性，一般不宜采用。另外，铁蛋白标记抗体的特点之一是分子量大。因此，如用于细胞表面抗原的定位研究，可将样品直接放入固定液，否则需采取适当的措施，打破细胞膜，增强细胞对标记抗体的通透性，常采取以下方法：

（1）冻融法：将小块组织或细胞经固定后，冻融一次，使细胞膜破裂，标记抗体能进入细胞内。

（2）冰冻切片法：固定后组织快速冷冻，切成10～15μm左右薄片，溶化的切片直接浸泡于铁蛋白标记抗体液中。

（3）有报道经戊干杯固定后，浸入4×10-3mol/L洋地黄皂甙液中1～2min，能有助于增强细胞膜的穿透性，使标记抗体液进入细胞内。

2．免疫反应处理 　常用包埋前染色，分直接法和间接法两种。在染色前，将组织切成约10～20μm厚的薄片。

（1）直接法：将薄片直接浸泡于标记抗体液中，室温或37℃作用1～2h或更长；缓冲液（有人提倡用冷缓冲液）浸漂，除去未结合的标记抗体溶液，然后转入常规双固定和电镜包埋。

（2）间接法：

①将组织切片浸于第一抗体液中，室温30～60min。

②以大量冷缓冲液充分搅拌洗涤，至少3次，每次30min。

③浸入铁蛋白标记抗体液中，室温30min。

④如②，用缓冲液充分洗涤后，可以自然沉淀或用离心方法捞取组织片。

⑤将离心沉淀小块，用四氧化锇固定30min。

⑥常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。