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DNA实验

DNA的提取实验

2024-05-22 DNA实验 加入收藏
原理酚为有效的蛋白质变性剂,并且饱和的酚与水相有效的分开.因此,在含核酸的样品加入酚,可将样品中的蛋白质变性后形成沉淀层,位于水相与有机相的界画,从而达到纯化核


原理

酚为有效的蛋白质变性剂,并且饱和的酚与水相有效的分开.因此,在含核酸的样品加入酚,可将样品中的蛋白质变性后形成沉淀层,位于水相与有机相的界画,从而达到纯化核酸的目的.但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚层中含有10-15%的水,从而溶解一部分poly-(A)RNA。将酚与氯仿联合使用即可克服这两方面的不足.氯仿除可使蛋白质变性外,还能加速水相与有机相的分层.在氯仿中加入少许异戊醇可减少油提生产生的泡沫.在酚-氯仿联合抽提核酸后,再加氯仿抽提一次;可除去样品中的痕量酚.

材料与仪器

熏蒸酚 氧仿 异戊醇 氯仿异戊醇混合液

步骤

实验试剂:

l. 饱和的熏蒸酚:市售AR经酚须在182度用空气冷凝管进行重蒸馏,冷却后加入8一羟基喹啉,使其浓度达到1g/L,向液体酚中加入等体0.5mlTris-HCL缓冲液(PH8.0),置磁力搅拌15min,抽取上层(水层)液体再加入等体积0.lmol/LTris-HCL缓冲液(pH8.0),同样搅拌15min,分相完全后吸取上层液体,最后向酚层(下层)加入1/10体积的含2g/L巯基二醇的0.1mol/LTris-HCL缓冲进(pH8.0),分装后避光20度保存,至少可用一个月,

2. 氧仿

3. 异戊醇

4. 氯仿/异戊醇混合液,比例为24:1或9:1

①8一羟基喹啉为黄色化合物,是一种抗氧化剂.又是酶的部分抑制剂和金属离子的弱结合剂.加入8一羟基喹啉使酚层呈黄色,又可作为识别的标记.

实验操作:

l. 样品加入等体积和酚或酚/氯仿(1:1)混合液.

2. 上下颠倒很匀.

3. 室温,12000转/分钟,离心5分钟.如蛋白质较多或分界不清时,可离心10分钟。

4. 吸取上层(水层)移置另一新的离心管中.

5. 加入等体积酚/氯仿/异戊酸(25:24:1)溶液.重复步骤2、 3、 4.

6. 加入等体积氯仿/异戊酸(24:1)溶液.重复步骤2、3、 4。

7. 乙醇沉淀核酸(见核酸的沉淀纯化).


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