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DNA实验

运用间期核荧光原位杂交对常见非整倍体的产前诊断

DNA
2024-05-30 DNA实验 加入收藏
材料与仪器乙醇 HCl NaOH 甲酰胺 甲醇 冰乙酸 柠檬酸钠 KCl 胰蛋白酶 SSCAneuVysion™ 试剂盒中提供的试剂步骤


材料与仪器

乙醇 HCl NaOH 甲酰胺 甲醇 冰乙酸 柠檬酸钠 KCl 胰蛋白酶 SSC
AneuVysion™ 试剂盒中提供的试剂

步骤

3 . 1 用于FISH检测的未培养胎儿细胞制备 3.1.1 未培养羊水细胞的制备 1 . 解 冻 4m L 胰蛋白酶/EDTA。 2 . 将 3〜5m L 清澈的羊水样品400g 离 心 IOmin (见 注 释 11)。 3 . 弃上清。 4 . 用 4m L 胰蛋白酶/EDTA液重悬细胞。 5 . 轻柔振荡细胞悬液。 6. 37°C孵育 20min。 7. 400g•离心 IOmin0 8 . 弃上清。 9 . 慢慢滴入37°C预 热 的 低 渗 液 （0 . 8 % 柠檬酸钠或0.56% KC1 ) 重悬细胞， 至 终 体 积IOmU 10. 37°C孵育 20min。 11. 400g 离心 IOmin0 12. 弃上清。 13. 力口2m L 固 定 液 （甲 醇 ：冰乙酸= 3 : 1 ) 重悬细胞，轻轻混匀。 14. 将细胞悬液于2〜8°C放置至少I h 或至制片时。 15. 按细胞团块大小调整加入固定液体积： 400g 离 心 IOmin, 弃上 清 ，加 0. 8〜2m L 固 定 液 （甲 醇 ：冰乙酸= 3 : 1 ) 重悬细胞。 16. 用钻石笔在1 或 2 张玻片的背面标记2 个 杂 交 区 域 （见 注 释 12)。 17. 在每一杂交区域滴约20^L 的 细 胞 悬 液 （见 注 释 1 3 和 14)。 18. 滴好的玻片可直接变性杂交（见 注 释 1 5 ) 或放于有盖的玻片盒内一20°C 保 存 待 用 （见 注 释 16)。 3. 1 . 2 未培养绒毛细胞的制备 ■ 1 . 在显微镜下彻底清洗绒毛（见 注 释 17)。
2 . 将 1 或 2 片干净的绒毛转到一个35m m 的培养皿内用于FISH。 3 . 吸去多余的液体。 4 . 在绒毛上逐滴加2m L 固 定 液 （甲 醇 ：冰乙酸= 3 : 1)，固定绒毛。 5 . 室温孵育l 〇min。 6 . 更 换 2m L 新鲜的固定液。 7 . 室温孵育lOmin。 8 . 移去固定液。 9 . 气干绒毛。 10. 加 0. 5〜0.8m L 解 离 液 （6 0 % 乙酸） 。 11. 室温孵育5min，可用细的玻璃滴管轻轻混合以促进细胞解离，解离液 加 入 2m in后可开始准备制片。 12. 用钻石笔在1 或 2 张玻片的背面标记2 个 杂 交 区 （见 注 释 12)。 13. 在每一标记杂交区滴约2(V L 的 细 胞 悬 液 (见 注 释 1 3 和 14)。 14. 滴好的玻片可直接变性杂交（见 注 释 1 5 ) 或放于有盖的玻片盒内一20°C 保 存 待 用 （见 注 释 16)。 3. 2 F I S H 分析步骤 3.2.1 —般 准 备 （见注释18) 1 . 将用于杂交的湿盒置于37°C 预热。 2 . 准 备 37°C水 浴 。 3 . 准 备 （73±1)°C水浴。 4 . 将玻片电热板预热至45〜50°C 。 3 . 2 . 2 标 本 预 处 理 （见注释19) 1 . 准 备 40m L 2 X SSC 加到染色缸内，在 37°C水浴锅内预热；将标本置于 37°C 2 XSSC 中 30min。 2 . 从染色缸内取出标本晾干。 3 . 准备三缸室温梯度乙醇（7 0 % 、 8 5 % 和 1 0 0 % ) 。 4 . 将标本放入7 0 % 乙醇中2min。 5 . 从 7 0 % 乙醇中取出，迅速移入8 5 % 乙醇中2min。 6 . 从 8 5 % 乙醇中取出，迅 速 移 入 1 0 0 % 乙醇中2min。 7 . 从染色缸中取出标本，晾干。 3. 2. 3 标本DNA的 变 性 （见注释20) 1 . 确认变性液p H 在 7. O〜8. O范围内。
•将变性液倒入染色缸内于（73±1)°C水 浴 中 预 热 至 少 45min，在用前确 认 缸 内 的 温 度 （见 注 释 21)。 3 . 将 准 备 好 的 标 本 （每次不超过3 张）置 于 （73±1)°C变性液中变性5min， 勿晃动。 4 . 准备三缸室温梯度乙醇（7 0 % 、 8 5 % 和 1 0 0 % ) 。 5 . 用镊子将标本从变性液中取出后立即置于7 0 % 乙醇处理2min，晃动玻片 去掉残留的甲酰胺。 6 . 从 7 0 % 乙醇中取出，迅速移入8 5 % 乙醇中2min。 7 . 从 8 5 % 乙醇中取出，迅速移入1 0 0 % 乙醇中2min。 8 . 用吸水纸从玻片边缘吸去残留的乙醇，擦干玻片背面。 9 . 在准备加探针前2m in将玻片置于45〜50°C恒温平台。 3. 2. 4 准备探针混合物 1 . 探针在室温条件下逐渐解冻。 2 . 振荡装探针的离心管。 3 . 用微型离心机稍离心（3〜5s)。 3. 2. 5 杂交 1. 加 lOpLCEP-18/X/Y 探 针 混 合 物 到 一 个 标 记 的 杂 交 区 域 ，立即盖上 22mm X22m m 盖 片 ，让溶液在盖片下均匀铺展，避免产生气泡。 2 . 加 IOjuL LSI-13/21探针混合物于另一标记的杂交区域，如上所述方法盖 上盖片。 3 . 用稀释的橡皮泥封片：用 5m L 注射器吸入橡皮泥，沿载玻片和盖玻片重 叠边缘滴加，在盖片周围封片。 4 . 将玻片放入37°C预热的湿盒，盖紧盖子， 37°C杂 交 6〜24h 。 3 . 2 . 6 杂 交 后 洗 脱 （见 注 释 20) 1 . 将 0. 3 % NP-40/0. 4 XSSC洗脱液加入染色缸内。 2 . 将 装 有 〇 .3%NP-40/0.4XSSC洗 脱 液的染色缸放于（73±1)°C水浴预热 至 少 30min。 3 . 准 备 0 . 1 % NP-40/2XSSC洗脱液于另一染色缸内，室温备用。 4 . 从杂交湿盒内取出玻片。 5 . 去掉一张标本的橡皮泥和盖片。 6•立即放于（73±1)°C 的 0 . 3 % NP-40/0.4XSSC洗脱液内。 7 . 晃动玻片3s 。 8 . 重复步骤5〜7 洗脱下一张玻片。
9 . 重 复 步 骤 5〜7 洗脱第三张玻片 ， 一 次洗脱不超过3 张玻片。 1 0 . 自最后一张玻片放入后计时洗脱2min。 11•将玻片逐张移入室温的〇 .l % NP-40/2X SSC洗脱液中，洗 脱 5〜60s。 12. 暗 处 晾 干 玻 片 （放于抽屉内关上即可） 。 13. 每一杂交区域加IOjLtL DAPI-II复染液，盖上盖片。 14. 玻片置于暗处保存待检（见 注 释 23)。 3 . 3 信号检测 3. 3 . 1 总体评估玻片 1 . 用 10X 、 25X 和 40X 物镜总体评估标本情况，转换不同滤光片评估不同 颜 色 的 信 号 （蓝色、橙色或绿色） 。 2 . 背景应该是暗的，几乎没有颗粒样荧光或模糊的影像。 3 . 用 25X 物镜扫描玻片，选择信号检测的合适区域。所选区域内的细胞应 稀疏分布，一个视野下可以看到斗个细胞，只有少数细胞重叠。避免细胞密集分 布 、许多细胞重叠或细胞成团的区域。 3. 3. 2 信号计数 1 . 选择一个滤光片，用 40X 物镜扫描所选区域，分析该区域的左上象限区 域 。自左向右扫描，并跳过细胞密集区域。 2 . 计数每个间期核内的一种特异探针信号的数量。探针信号应明亮、清晰、 易于观察。信号呈明亮致密或线状弥散在卵形核内。有时信号分成明亮的、距离 非常近的两团，这种分开的信号可以作为一个信号计数。 3 . 继续扫描至计数5 0 个核，对特异靶进行分析。 4 . 对 5 种探针分别重复步骤1〜3 , 在不同滤光片下扫描相应的杂交区域。 5 . 在特定记录文件中记录结果。 6 . 对每种探针拍样品照片（数字化或幻灯） 。 7 . 在专门设计的报告纸上报告结果，每 个 靶 探 针 计 数 5 0 个 间 期 核 ，记录 LSI-13、 LSI-2 1 和 CEP-18出 现 1 个 、 2 个 、 3 个 、 4 个 和 4 个以上信号的细胞数 量和百分比。有关性染色体的报告需具有X、 Y 、 XX、 XY、 XXY、 XYY、 XXX 及其他的核数量和百分比。 3 . 4 结果判断 1 . 对一个靶信号的计数少于5 0 个 间 期 核 ，应进行增补实验或者判断为无
结果。 2 . 如果至少8 5 % 的细胞为整倍体，确诊为整倍体。 3 . 如果至少8 5 % 的细胞具有同样的非整倍体信号，确诊为非整倍体。 4 . 如果超过1 0 % 的细胞具有同样的非整倍体信号，应继续分析100〜200个 细胞。根据绝大部分细胞中检测到的信号， FISH 进行最终确诊。怀疑为嵌合体 的病例，应进行标准的细胞遗传学分析。 4 . 注释 1 . 我们的实验操作程序主要基于其他已经发表的文献，并结合我们自身十 多年的经验建立的。变性、杂交和洗脱方法基于购买的AneuVysion™ 分析试剂 盒 ，总体按照Vysis建议的方法进行实验。 2 . 在适合的临床条件下，快 速 F IS H 分析未培养胎儿细胞对主要常见非整 倍体进行产前诊断是非常有效的工具。然而，临床医生应经过培训、患者应仔细 咨询了解用FISH 进行常规产前细胞遗传学分析的优势和局限性。应该强调实验 不能发现结构染色体异常、嵌 合 体 或 13、 18、 21、 X 和 Y 之外的染色体数量异 常 6 这些局限性也应该在FISH 结果的最终报告中详细注明。 3 . 本实验要求好的实验室经验和强制性学习曲线。在该技术用作临床工具 之前，建议在细胞遗传学实验室中进行实验至少50〜100个病例。实验过程中得 到 的 FISH 结果与作为内对照的标准细胞遗传学分析结果相比较。实验只用作学 习目的，不报告给临床医生和患者。 4.. ProbeCheck™ 阳性对照和阴性对照标本包括在AneuVysion™ 试剂盒中。 正常男性和嵌合体羊水细胞分别作为阴性对照和阳性对照。这些对照标本可用来 进行质量控制和培训技术人员对间期细胞F IS H 的结果判断。 5 . 对成功的FISH 杂交结果观察失败可能是荧光显微镜故障或状态不理想， 或错误的滤光片选择造成的。应进行常规的显微镜清洁，定期由技术代表进行检 查 。激发光源应该正确安装，它的使用时间应该记录，使 用 寿 命 大 约 为 200h 。 物镜根据放大倍数决定使用或不使用镜油。使用的镜油应该无自发荧光、专门用 于荧光显微镜。建议使用适合AneuVysion™ 试剂盒的多带通和单带通荧光显微 镜滤光片。 Vysis公司备有适于各种显微镜的滤光片。用浅蓝绿色、绿色和橘黄 色荧光标记CEP-18/X/Y 和 LSI-13/21探针杂交的染 色 体 可 以 用Aqua、 Green 或 Orange的单通道滤光片观察，也 可 以 用 DAPI/Green/Orange三通道滤光块 阅片。 SpectrumAqua信号呈现浅绿蓝色， SpectrumOrange信号呈现粉橘黄色， SpectnimGreen信号呈现绿黄色。其 他 DNA用 DAPI染成蓝色。 6 . 建议用校准的温度计测量溶液、水浴锅和培养箱的温度，因为这些温度 对结果非常重要。
7 . 未拆包装的AneuVysion™ 试剂盒在一20°C干燥避光条件下保存。开封的 试剂盒的不同组分按下述说明保存 ： DNA 探针混合物、 DAPI-I I 复染剂和对照 标本在一20°C避光干燥保存； 20X SSC 盐 和 NP-40室温保存。未开封试剂盒各 组分的过期时间在各自的包装说明中注明，这些保存条件适用于开封和未开封的 '组成。 8 . 荧光素在曝光后淬灭。为减少荧光淬灭，所有含有荧光团的溶液应该在 弱光下操作。包括已经杂交标本的所有后续操作步骤。所 有 避 光 的 操 作 （孵育过 程 、洗脱等)应在柔和光线下进行，避免强光直接照射荧光素。 9 . 甲酰胺是一种众所周知的致畸剂，用于制备变性液和探针混合物。应避 免皮肤和黏膜接触。 10. DAPI-I I 复染剂中含有D A PI和 1 ，4-苯二胺游离碱。根据阳性基因毒性 效 应 ， DAPI是可能的致突变剂，避免吸入、误食或皮肤接触。 1 ，4-苯二胺是一 种已知的皮炎致敏剂和潜在的呼吸致敏剂，避免吸入、误食或与皮肤接触。 11. 只用清澈的黄颜色羊水进行FISH。血红色或褐色的羊水，或含许多红 细胞的细胞团块可能影响结果，得到错误的判断。 12. 玻片应该清洁、冰冷。将玻片保存在冰箱中，滴片前用冰冷的固定液洗 片 。不干净的玻片导致髙背景和妨碍阅片。 13. 大 多 数 细 胞 遗 传 实 验 室 的 技 术 员 对 滴 片 经 验 丰 富 ，然 而 ，对间期核 FISH 实验来说，滴片是确保优质结果的重要步骤。稀疏分布的细胞限制观察者 选择状态最好的细胞核来计数信号，细胞过于稠密的杂交区域很难将细胞和信号 相联系。正确的滴片保证结果观察的方便和直观。在滴片前根据细胞团块的大小 调节悬液体积，从尝试和错误中吸取经验，滴出高质量的标本。 14. 因 为 AneuVysion™ 试剂盒 由 两 套 探 针 构 成 ： LSI-13/21和 CEP-18/X/ Y ，每个病例最少要求两个杂交区域 。 一 张玻片上制备2 个杂交区域对技术要求 不是太高，但一张片子上找一个杂交区域比较简单。每张试验片最好制备一个备 份 ，备份标本不进行杂交，放在有盖的盒子中一20°C保存。 15. 标本质量是影响杂交程度的重要因素。建议在变性和杂交前，在相差显 微镜下检查标本的质量。评估玻片上的细胞密度和间 期 核 周 围 细 胞 质 的 存 在 与否。 16. 在标本制备和操作的某些阶段可长期保存样本。未滴片的在固定液中的 羊水细胞或绒毛细胞悬液可以在一 20°C冷冻保存。制备好的标本在杂交前也可以 保存在有盖的盒子中，放入塑料袋封口后 ， 一 20°C保存。 17. 只选择干净的绒毛进行分析。因蜕膜或母血污染的样本可能影响结果， 导致错误的判断。蜕膜外观通常为白色球状组织，没有发芽或血管，它们通常具 有 海 绵 样 或 “糊状”外 观 。好的绒毛具有发芽的白色分支，至少一些分支上有 血管。
18. HYBrite™ 变性/杂交系统是Vysis生产的一种按键操作仪器，它可以同 时 对 1 2 张玻片进行变性和杂交。减少对变性试剂、水浴锅和孵育设备的需求， 节省大约45miti操作时间。用 HYBrite™ 进行操作更简便、更安全。我们认为实 验操作程序更准确，对困难样本也能得到更好的结果。 19. 标本预处理是选择性的。只 有 妊 娠 后 期 （超 过 1 8 周 ）的羊水才需要预 处理。我们采用如上所述的方法处理所有样品，再进行间期核FISH 分析。 20. 在每个染色缸中一次不能变性或洗脱3 张以上的标本。 21. 严格控制温度和缓冲液浓度对变性非常重要。变 性 液 温 度 必 须 为 （73士 1)°C ，每次使用前进行确认。变性液的p H 在每次使用前也必须调至7.0〜8.0。 22. 对最后一次乙醇洗脱、将玻片转移到玻片电热板上以及加土探针混合物 等步骤严格计时，这对杂交成功非常重要。如果在探针准备好之前，玻片需要等 待 超 过 2min，应该将玻片放在1 0 0 % 乙醇中等待杂交。 23. 杂交标本盖上盖玻片后在一20BC避光保存。在这样的保存条件下，杂交 标本可以保存一年以上而荧光信号强度基本没有损失。


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