制备YAC DNA进行Southern印迹分析
材料与仪器酵母菌AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 异丙醇 NaCl培养箱 离心管 转子步骤1. 接种一个红色的
材料与仪器
酵母菌
AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 异丙醇 NaCl
培养箱 离心管 转子
AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 异丙醇 NaCl
培养箱 离心管 转子
步骤
1. 接种一个红色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培养基的250 ml 三角烧瓶中，在旋转摇床上30℃ 250 r/min 振荡培养24 h。
2. 扩大培养：取1ml 由步骤1获得的粉红色菌悬液接种于盛有100 ml AHC培养基的 1 000 ml三角烧瓶中，于30℃ 250 r/min摇床培养24 h。
3. 将菌悬液移入2个50 ml 的锥形离心管中，于2 000 g 离心5 min，弃上清，共用5 ml SCE缓冲液重悬菌体，并合并到一个试管中。
4. 加1 ml SCEM缓冲液，在旋转摇床中37℃ 100 r/min 轻摇晃混匀。
5. 于4℃ 2 000 g 离心弃上清，菌体用5 ml Tris/EDTA裂解液重悬。
6. 加0.5 ml 10%SDS颠倒混合数次，于65℃温育20 min。
3. 将菌悬液移入2个50 ml 的锥形离心管中，于2 000 g 离心5 min，弃上清，共用5 ml SCE缓冲液重悬菌体，并合并到一个试管中。
4. 加1 ml SCEM缓冲液，在旋转摇床中37℃ 100 r/min 轻摇晃混匀。
5. 于4℃ 2 000 g 离心弃上清，菌体用5 ml Tris/EDTA裂解液重悬。
6. 加0.5 ml 10%SDS颠倒混合数次，于65℃温育20 min。
7. 加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲缓冲液，颠倒混合数次后置于冰浴60 min。
8. 于室温2 000 g 离心10 min，小心将含核酸的上清转移到一个新管中。加室温2倍体积的95%乙醇，颠倒混匀。
9. 于室温2 000 g 离心5 min，弃上清，在室温晾干10~15 min，分别加入3 ml TE缓冲液，pH8.0于37℃过夜溶解核酸。
10. 加入0.1 ml 的1 mg/ml 无DNA酶活性的RNase A，于37℃温育1 h。
8. 于室温2 000 g 离心10 min，小心将含核酸的上清转移到一个新管中。加室温2倍体积的95%乙醇，颠倒混匀。
9. 于室温2 000 g 离心5 min，弃上清，在室温晾干10~15 min，分别加入3 ml TE缓冲液，pH8.0于37℃过夜溶解核酸。
10. 加入0.1 ml 的1 mg/ml 无DNA酶活性的RNase A，于37℃温育1 h。
11. 加入6 ml 室温的异丙醇，振荡并颠倒混匀后用一支毛细管缠绕起染色体，然后溶于0.5 ml TE缓冲液中。
12. 加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇，颠倒混匀。
13. 再一次缠绕起染色体DNA，并溶于0.5 ml TE缓冲液中，于4℃保存备用。
12. 加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇，颠倒混匀。
13. 再一次缠绕起染色体DNA，并溶于0.5 ml TE缓冲液中，于4℃保存备用。
14. 取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以构建YAC文库的某物种或个体的基因组DNA。
15. 采用几种高频切割的限制性内切酶进行酶切，接着用单拷贝探针进行杂交和核酸印迹分析。
15. 采用几种高频切割的限制性内切酶进行酶切，接着用单拷贝探针进行杂交和核酸印迹分析。
16. 一旦通过核酸印迹实验确证YAC克隆，那么可通过制备染色体凝胶校块塞和进行脉冲电场凝胶电泳，来明确重组YAC的大小并对其稳定性进行初步评价。
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