DNA 测序（自动测序法）

ABI  PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

 

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。

 

由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

 

1.  BigDye测序反应试剂盒  主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。

2.  pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板  0.2 g/L，试剂盒配套试剂。

3.  M13(-21)引物  TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 umol/L，即3.2 pmol/ul，试剂盒配套试剂。

4.  DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 ul为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2 g/L，即200 ng/ul。

5.  引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/ul。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6.  灭菌去离子水或三蒸水。

7.  0.2 ml或和0.5 ml的PCR管  盖体分离，PE公司产品。

8.  3 mol/L 醋酸钠(pH5.2)  称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100 ml，高压灭菌后分装。

9.  70%乙醇和无水乙醇。

10.  NaAc/乙醇混合液  取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。

11.  POP 6测序胶  ABI产品。

12.  模板抑制试剂(TSR)  ABI产品。

13.  10x电泳缓冲液  ABI产品。

14.  ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。

15.  2400型或9600型PCR仪。

16.  台式冷冻高速离心机。

17.  台式高速离心机或袖珍离心机。

二、PCR测序反应
 

1.  取0.2 ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

所加试剂                                 测定模板管          标准对照管

BigDye Mix                                   1 ul                  1 ul 

待测的质粒DNA                             1 ul                    －

pGEM-3Zf (+) 双链DNA                 －                    1 ul 

待测DNA的正向引物                       1 ul                    －

M13(-21)引物                                 －                   1 ul 

灭菌去离子水                                2 ul                  2 ul 

总反应体积5 μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。
 

2.   将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
 

三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
 

1.   将混合物离心，将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
 

2.  加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min，小心弃上清。
 

3.   加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
 

四、电泳前测序PCR产物的处理
 

1.  加入12 μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。
 

2.   将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中，稍离心。
 

3.  在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min)，冰中骤冷，待上机。
 

五、上机操作  

1.  按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。

2.  仪器将自动灌胶至毛细管，1.2 kV预电泳5 min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下电泳2 h。

3.  电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。

4.  每一个样品电泳总时间为2.5 h。

5.  电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
 

六、序列分析

仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。
 

七、仪器清洗

测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
 

八、计算
 

1.  测序反应精确度计算公式：100%－差异碱基数(不包括N数)/650x100%。
 

2.  差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。

1.  ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。

2.  本实验测序PCR反应的总体积是5 ul，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4～4.5 ul ，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。

3.  作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30～90 ng，单链DNA需50～100 ng，双链DNA需200～500 ng，DNA的纯度一般是A260 nm/A280 nm为1.6～2.0，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2 pmol/ul 较好。

4.  本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650 bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %，仪器不能辨读的碱基N＜2%，所需测定的长度超过了650 bp，则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。