用蛋白酶K和SDS从大规模培养物中提取λ噬菌体DNA实验
原理通过一种有效的蛋白酶（如蛋白酶 K ) 的消化作用及随后的酚：氯仿抽提，就能从大规模制备的 λ 噬菌体中很好地分离到 DNA。该方法也适用于小量（50~10
原理
通过一种有效的蛋白酶（如蛋白酶 K ) 的消化作用及随后的酚：氯仿抽提，就能从大规模制备的 λ 噬菌体中很好地分离到 DNA。该方法也适用于小量（50~100 ml ) 制备物。
材料与仪器
蛋白酶 K 限制性内切核酸酶 λ 噬菌体颗粒
氯仿 透析缓冲液 EDTA 乙醇 酚 酚：氯仿 SDS 乙酸钠 TE
琼脂糖凝胶 Sorvall SS-34 转子或相当型号 硼硅酸盐巴斯德吸管 水浴
氯仿 透析缓冲液 EDTA 乙醇 酚 酚：氯仿 SDS 乙酸钠 TE
琼脂糖凝胶 Sorvall SS-34 转子或相当型号 硼硅酸盐巴斯德吸管 水浴
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
(1) 氯仿
(2) 透析缓冲液
10 mmol/L NaCl
50 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0)
10 mmol/L MgCl2
需要两份透析缓冲液，每份为噬菌体溶液体积的 1000 倍，室温保存。
(3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
(4) 乙醇
(5) 酚
(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）
(7) SDS (10%，m/V)
(8) 乙酸钠（3 mol/L，pH 7.0)
(9) TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
蛋白酶 K
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 离心机和转子
Sorvall SS-34 转子或相当型号
5. 专用设备
硼硅酸盐巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 钩
透析袋，煮过
预置 56℃ 的水浴
6. 载体和菌株
于 CsCl 悬浮液中的 λ 噬菌体颗粒
二、方法
噬菌体悬浮液的透析
1. 将制备好的噬菌体悬浮液装入一端打结或用塑料夹进行封闭的透析袋内，然后封住透析袋的另一端，放入含超过 1000 倍的透析缓冲液和一磁力搅拌器的烧杯中，于室温慢慢搅拌中透析 1 h。
2. 将透析袋转移至另一装有新鲜缓冲液的烧杯中，再透析 1 h。
3. 将噬菌体悬浮液转入聚丙烯离心管中。
不要超过管体积的 1/3。
4. 在透析过的噬菌体悬浮液中加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 至终浓度为 20 mmol/L。
噬菌体颗粒的抽提
5. 在悬浮液中加入蛋白酶 K 至终浓度为 50 μg/ml。
6. 加 SDS 至终浓度为 0.5%，通过将离心管轻轻地上下颠倒数次进行混匀。
溶液的外观将快速改变，从略显蓝色的噬菌体颗粒悬浮液转变成含病毒 DNA 和病毒外壳蛋白裂解物的清亮溶液。
7. 将消化混合物于 56℃ 温育 1 h，然后冷却至室温。
8. 加入等体积的平衡酚，通过将离心管轻轻上下颠倒数次，混匀有机相和水相，直至形成一完全的乳状液。
9. 3000 g（5000 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）室温离心 5 min 将两相分离，用宽口吸管将亲水相转移至一干净离心管中。
10. 用 1:1 的平衡酚和氯仿混合物抽提亲水相。
11. 如上所述（步骤 9 ) 回收亲水相，用等体积的氯仿重新抽提一次。大规模制备，转入步骤 12。
小量制备（从 50~100 ml 培养物中制备的噬菌体）
(1) 用标准乙醇沉淀回收噬菌体 DNA。
(2) 将溶液于室温放置 30 min。
当加入乙醇后，λ 噬菌体 DNA 将出现丝状沉淀，可用口封住的硼硅酸盐巴斯德吸管或 Shepherd 钩从溶液中捞出。
(3) 将 DNA 重新溶解于适当体积的 TE ( pH 7.6) 中，转入步骡 14。
CsCl 的去除
12. 将亲水相转移至透析袋中。
13. 将噬菌体 DNA 样品于 1000 倍的 TE ( pH 8.0) 中 4℃ 透析过夜，其间 TE 溶液更换三次。
14. 测定溶液 260 nm 处的吸光值，计算 DNA 的浓度。
1OD260=50 μg/ml 双链 DNA。单个噬菌体颗粒大约含有 5X10-11 μg DNA。噬菌体 DNA 的得率依赖于裂解培养物中噬菌体的滴度，通常为每升 500 μg 至数毫克。
15. 采用适当大小的分子质量标准，经 0.7% 琼脂糖电泳分析未消化的或已用适当限制酶切割的部分 DNA ( 0.5 μg)，检査噬菌体 DNA 的完整性。
16. 将噬菌体 DNA 于 4℃ 保存。
1. 缓冲液和溶液
(1) 氯仿
(2) 透析缓冲液
10 mmol/L NaCl
50 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0)
10 mmol/L MgCl2
需要两份透析缓冲液，每份为噬菌体溶液体积的 1000 倍，室温保存。
(3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
(4) 乙醇
(5) 酚
(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）
(7) SDS (10%，m/V)
(8) 乙酸钠（3 mol/L，pH 7.0)
(9) TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
蛋白酶 K
限制性内切核酸酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙锭
4. 离心机和转子
Sorvall SS-34 转子或相当型号
5. 专用设备
硼硅酸盐巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 钩
透析袋，煮过
预置 56℃ 的水浴
6. 载体和菌株
于 CsCl 悬浮液中的 λ 噬菌体颗粒
二、方法
噬菌体悬浮液的透析
1. 将制备好的噬菌体悬浮液装入一端打结或用塑料夹进行封闭的透析袋内，然后封住透析袋的另一端，放入含超过 1000 倍的透析缓冲液和一磁力搅拌器的烧杯中，于室温慢慢搅拌中透析 1 h。
2. 将透析袋转移至另一装有新鲜缓冲液的烧杯中，再透析 1 h。
3. 将噬菌体悬浮液转入聚丙烯离心管中。
不要超过管体积的 1/3。
4. 在透析过的噬菌体悬浮液中加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 至终浓度为 20 mmol/L。
噬菌体颗粒的抽提
5. 在悬浮液中加入蛋白酶 K 至终浓度为 50 μg/ml。
6. 加 SDS 至终浓度为 0.5%，通过将离心管轻轻地上下颠倒数次进行混匀。
溶液的外观将快速改变，从略显蓝色的噬菌体颗粒悬浮液转变成含病毒 DNA 和病毒外壳蛋白裂解物的清亮溶液。
7. 将消化混合物于 56℃ 温育 1 h，然后冷却至室温。
8. 加入等体积的平衡酚，通过将离心管轻轻上下颠倒数次，混匀有机相和水相，直至形成一完全的乳状液。
9. 3000 g（5000 r/min 于 Sorvall SS-34 转子中）室温离心 5 min 将两相分离，用宽口吸管将亲水相转移至一干净离心管中。
10. 用 1:1 的平衡酚和氯仿混合物抽提亲水相。
11. 如上所述（步骤 9 ) 回收亲水相，用等体积的氯仿重新抽提一次。大规模制备，转入步骤 12。
小量制备（从 50~100 ml 培养物中制备的噬菌体）
(1) 用标准乙醇沉淀回收噬菌体 DNA。
(2) 将溶液于室温放置 30 min。
当加入乙醇后，λ 噬菌体 DNA 将出现丝状沉淀，可用口封住的硼硅酸盐巴斯德吸管或 Shepherd 钩从溶液中捞出。
(3) 将 DNA 重新溶解于适当体积的 TE ( pH 7.6) 中，转入步骡 14。
CsCl 的去除
12. 将亲水相转移至透析袋中。
13. 将噬菌体 DNA 样品于 1000 倍的 TE ( pH 8.0) 中 4℃ 透析过夜，其间 TE 溶液更换三次。
14. 测定溶液 260 nm 处的吸光值，计算 DNA 的浓度。
1OD260=50 μg/ml 双链 DNA。单个噬菌体颗粒大约含有 5X10-11 μg DNA。噬菌体 DNA 的得率依赖于裂解培养物中噬菌体的滴度，通常为每升 500 μg 至数毫克。
15. 采用适当大小的分子质量标准，经 0.7% 琼脂糖电泳分析未消化的或已用适当限制酶切割的部分 DNA ( 0.5 μg)，检査噬菌体 DNA 的完整性。
16. 将噬菌体 DNA 于 4℃ 保存。
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