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DNA实验

RNA的甲醛变性电泳

2024-05-25 DNA实验 加入收藏
原理用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多,电泳迁移率低;而RNA中以rRNA最多,占到80%~85%,t


原理

用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多,电泳迁移率低;而RNA中以rRNA最多,占到80%~85%,tRNA及核内小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不见的。故可通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果。
 

材料与仪器

植物总RNA
加样运载缓冲液 TAE Buffer 甲醛凝胶电泳缓冲液 甲醛 甲酰胺
电泳装置 外透射观测仪

步骤

一、材料、试剂和仪器
 
1.  材料:植物总RNA 5-10 ug
 
2.  试剂
 
(1)加样运载缓冲液(Loading buffer)
50% 甘油
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.25%溴酚蓝
25%二甲苯氰FF
 
(2)10xTAE Buffer
 
(3)5x甲醛凝胶电泳缓冲液:
0.1 mol/L MOPs (pH7.0)
40 mmol/L乙酸钠
5 mmol/L DETA(pH8.0)
 
(4)甲醛,甲酰胺
 
3.  仪器:电泳装置,紫外透射观测仪
 
二、实验程序
 
1.  甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制
 
在250 mL的锥形瓶中准确称量2 g Agarose (Sigama),再加20 mL 10xTAE Buffer,144 mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5 ug/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。
 
2.  RNA的甲醛变性电泳
 
(1) 样品制备
RNA总量:10 ug
5×甲醛凝胶电泳缓冲液:4 ul
甲醛: 3.5 ul
甲酰胺:10 ul
加入无菌离心管中混合,95℃水浴变性2 min(或55℃,15 min),取出后放入冰中冷却。
 
(2) 加入2 ul无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度,以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,便于加样操作;能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时,溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4 kb 的双链线状DNA相同。)
 
(3)将胶板浸没在1x甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5 V/cm预跑5 min。点样后3-4 V/cm电泳。
 
(4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8 cm处),紫外灯下观察, 照相。
 

注意事项

每一泳道至多可分析30mg RNA,通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA含量极微,每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。

常见问题

每一泳道至多可分析30mg RNA,通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA含量极微,每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。


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