质粒构建技术（重组酶构建质粒）

基于同源基因重组原理，适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50bp~10kb 片段，同时构建时间也大大缩短。

DNA片段、引物、限制性核酸内切酶

DNA 连接酶

1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。在 200 μl 的离心管中，加入以下试剂：

试剂                              体积

载体                              1~2 μg

酶切缓冲液（10×）       5 μl

内切酶1                         1 μl

内切酶2                         1 μl

ddH2O                          to 50 μl

混匀后，点动离心将反应液甩至管底。37 ℃ 保温 2 h 进行酶切反应。

2. 对于使用重组方式连接来说，PCR 要设计引物， 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR 扩增方式进行连接，PCR 的产物要纯化。

3. 目的引物与线性载体进行重组反应。

4. 转化。将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。

5. 挑取单克隆，并鉴定。挑取平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。