质粒构建技术（同源重组法构建质粒）

质粒的构建是分子生物学研究中常用的实验技术，质粒是能够自主复制的环状 DNA 分子，将特定的基因序列插入到工程质粒中，再把质粒转化到细菌、细胞或酵母中，使质粒在其中表达。

将选定的目的外源基因（DNA）经过 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段，再使用 DNA 连接酶将切割后的载体与 DNA 片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选和测序鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的表达。

外源蛋白的过表达。

目的片段的 cDNA，引物，载体，限制性内切酶，酶切 buffer，LB 培养基，含 LB 培养基的细菌培养皿，同源重组酶，高保真酶，感受态细胞 DH5α，胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒，EP 管，离心管，移液枪及枪头等。

同源重组法构建质粒的步骤如下：

1、根据目的片段的酶切位点，选择响应的内切酶，通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体，用琼脂糖凝胶法回收酶切产物，回收方法按照试剂盒操作。

2、用 PCR 法扩增目的片段的序列，用琼脂糖凝胶法回收扩增产物。

3、将线性化的载体与扩增的片段按比例进行连接，37 ℃，30 min 或更长时间（1~2 h）。将连接好的重组质粒（10 μl）转入克隆感受态细胞 DH5α，轻轻吹打均匀，切勿振荡混匀，冰上静置 30 min，然后 42 °C 水浴热激 90 s，立即置于冰上静置冷却 2~3 min。

4、加入 500 μl 不添加抗生素的 LB 液体培养基，37 ℃ 摇菌 1 h， 转速 250 rpm。

5、将上一步的菌液 5 000 rpm 离心 5 min，弃掉 300 μl 上清。用剩余培养基将菌体重悬，最好按不同梯度涂板，防止单克隆菌过密或过疏，用无菌涂布棒在含有质粒抗性的平板上涂匀后，置于 37 ℃ 培养箱中培养 10~12 h。

6、过夜后，用 1 μl 枪头挑单克隆菌，置于 5 ml 的含抗生素的 LB 液体培养基中，继续培养 10~12 h。

7、质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒后，用限制性内切酶消化后，进行琼脂糖电泳做酶切鉴定。

8、第 7 步的同时，可以吸取部分菌液做菌液 PCR，PCR 产物琼脂糖凝胶电泳看条带大小，进一步鉴定重组质粒是否正确。

9、将鉴定成功的菌液送测序公司进行双向测序，待序列结果比对正确后，表示重组质粒构建成功，可以进行下游实验。

1. 构建质粒时，目的基因的片段不要大于载体的长度，如果基因片段为载体长度的 1/2 以上，会加大连接的难度。

2. 如果后续的质粒要做蛋白表达，那么在一开始选择载体的酶切位点时，就要注意是否会发生移码突变，否则后续蛋白表达会出错。

3. 同源重组法的引物设计需要在插入片段正/反向 PCR 引物 5' 端引入线性化载体的末端序列，使得 PCR 产物 5' 和 3' 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15~20 bp)，同源臂的 GC 含量尽可能低于 60 %，酶切序列可以选择性加，如果加的话，可以方便后续的酶切鉴定。

4. 做感受态转化实验时，注意重组质粒的体积不超过感受态的 1/10，否则实验可能失败。

1. 胶回收的产物低，浓度不足以做连接时，可以增加实验的起始量，因为大部分胶回收试剂盒的回收率仅为 30%~60%，所以载体酶切和扩增片段时可以用 200 μl 的跑胶体积。

2. 扩增的 PCR 产物无条带或者条带弱时，需要检查引物的 Tm 值以及 GC 比，可以更换引物或者改变 PCR 的条件，使其达到最优。

3. 涂板后没有菌落或很少菌落时，可能是线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足或过量，或者比例不佳，也可能使用单酶切载体后，载体自连所致，建议使用双酶切法切割载体，防止自连。

4. 菌液 PCR 无条带，可能是载体连接不成功，引物设计问题所致。