GST 融合蛋白沉降技术检测蛋白质
材料与仪器细胞裂解液 其中蛋白质 35S 用标记裂解缓冲液 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 探针 GST 蛋白沸水浴 翻转祥品旋转仪 谷胱甘肽琼脂糖球珠步骤材料缓冲液和
材料与仪器
细胞裂解液 其中蛋白质 35S 用标记
裂解缓冲液 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 探针 GST 蛋白
沸水浴 翻转祥品旋转仪 谷胱甘肽琼脂糖球珠
裂解缓冲液 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 探针 GST 蛋白
沸水浴 翻转祥品旋转仪 谷胱甘肽琼脂糖球珠
步骤
材料
缓冲液和溶液
将缓冲液稀释到适当浓度。
裂解缓冲液
20 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
200 mml/L NaCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
0.5% Nonidet P-40
使用前加入蛋白酶抑制剂达到下述终浓度：2ug/ul 抑肽酶（aprotinin)、1ug/ul 白胃素（leupeptin)、0.7ug/ml 胃酶抑素（pepstatin) 及 25ug/ml 苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)
溶于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中的还原型谷胱甘肽（20 mmol/L)
可选，请见步骤 8。
2xSDS-PAGE 加样缓冲液
凝胶
SDS 聚丙烯酰胺凝胶
关于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的详情请见附录 8。
专用设备
沸水浴
翻转祥品旋转仪
谷胱甘肽琼脂糖球珠
在裂解缓冲液中制成 50% 悬液。
探针
GST 蛋白
带有“诱饵”或探针序列的 GST 融合蛋白
按第 15 章方案 1 描述的方法构建。
细胞和组织
细胞裂解液，其中蛋白质 35S 用标记
根据实验目的和所需检测方法，可用非标记的细胞裂解液。进一步的详情，请见方案介绍。
附加试剂
此方案的步骤 11 需要如附录 8 列出的蛋白质免疫印迹和染色试剂，这些蛋白质是由 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的。
方法
预清除细胞裂解液
1. 将细胞裂解液与 50ul 的 50% 谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和 25ug GST 在 4°C 翻转混合孵育 2 h。需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于 1X106~1X107 个细胞的裂解液。
由于实验的目的是比较 GSTT 与 GST 融合蛋白，有必要对每个反应制备足够量的预清除裂解液。试剂有效地混合是成功的关键。为达到此目的，反应应在一个合理的体积中进行：一个好的起始值是 500~1000ul。
这种预清除步骤是要从裂解液中去除与 GST 成分或球珠有非特异性相互作用的蛋白质。如果相互作用的检测主要是用针对候选相互作用蛋白质的抗体，那么用 GST 或谷胱甘肽琼脂糖球珠做预淸除并不总是必需的。然而，在用 35S 标记的细胞裂解液用于确定新的蛋白质-蛋白质间相互作用时，这些步骤有助于降低本底。如果是用针对候选相互作用蛋白质的抗体来检测相互作用，包含两种对照很重要：GST 加球珠和仅有球珠。
如果相互作用的目的蛋白已知存在于专门的细胞部位. 那么探针应当与对应那种细胞部位的细胞裂解液组分孵育。
2. 在微量离心机上以最大速度在 4°C 离心混合物 2 min。
3. 将上清（就是预清除的细胞裂解液）转移到新的离心管中。
探测细胞裂解液
4. 设定两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约 10ug GST 蛋白，另一管中加约 10ug 的 GST 融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应当是等摩尔 (就是说 GST 的终浓度应当与 GST 融合探针蛋白相同）。将离心管在 4°C 翻转混合孵育 2 h。
重要：如果结合蛋白是通过煮沸而从球珠上去除（步骤 10), 那么引入仅含谷胱甘肽琼脂糖球珠和细胞裂解液的对照是重要的，它可检测到与球珠非特异性结合的蛋白质。
5. 在微量离心机上以最大速度离心样品 2 min。
6. 在新的微量离心管中收集上清。这些样品可通过步骤 10 中的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
7. 用1ml 冰冷的裂解液洗球珠。在微量离心机上以最大速度离心 1 min。弃去上清。重复洗三次。
8.(可选）加人 50ul 20 mmol/L 的还原型谷胱甘肽（在 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-Cl 中）到球珠中，洗脱 GST 融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在微量离心机上以最大速度离心 2 min。
9. 将球珠（来自步骤 7) 或洗脱蛋白质（来自步骤 8) 与等体积的 2XSDS-PAGE 上样缓冲液混合。
检测相互作用蛋白质
10. 将样品煮沸 4 min 并做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
11. 检测与 GST 融合蛋白结合的蛋白的方法取决于细胞裂解液是否被 35S 标记以及实验的目的。
(1) 如果目的是检测与融合蛋白结合的所有 35S 标记的蛋白，就在干胶仪上将胶抽干，并用 X 线胶片曝光进行放射自显影。
(2) 如果目的是检测特异性结合的蛋白质，就将蛋白质从 SDS 聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上，进行免疫印迹分析（附录 8)。
(3) 如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液，就用考马斯亮蓝或硝酸银将胶染色（附录 8）。
缓冲液和溶液
将缓冲液稀释到适当浓度。
裂解缓冲液
20 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
200 mml/L NaCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
0.5% Nonidet P-40
使用前加入蛋白酶抑制剂达到下述终浓度：2ug/ul 抑肽酶（aprotinin)、1ug/ul 白胃素（leupeptin)、0.7ug/ml 胃酶抑素（pepstatin) 及 25ug/ml 苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)
溶于 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 中的还原型谷胱甘肽（20 mmol/L)
可选，请见步骤 8。
2xSDS-PAGE 加样缓冲液
凝胶
SDS 聚丙烯酰胺凝胶
关于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的详情请见附录 8。
专用设备
沸水浴
翻转祥品旋转仪
谷胱甘肽琼脂糖球珠
在裂解缓冲液中制成 50% 悬液。
探针
GST 蛋白
带有“诱饵”或探针序列的 GST 融合蛋白
按第 15 章方案 1 描述的方法构建。
细胞和组织
细胞裂解液，其中蛋白质 35S 用标记
根据实验目的和所需检测方法，可用非标记的细胞裂解液。进一步的详情，请见方案介绍。
附加试剂
此方案的步骤 11 需要如附录 8 列出的蛋白质免疫印迹和染色试剂，这些蛋白质是由 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的。
方法
预清除细胞裂解液
1. 将细胞裂解液与 50ul 的 50% 谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和 25ug GST 在 4°C 翻转混合孵育 2 h。需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用相当于 1X106~1X107 个细胞的裂解液。
由于实验的目的是比较 GSTT 与 GST 融合蛋白，有必要对每个反应制备足够量的预清除裂解液。试剂有效地混合是成功的关键。为达到此目的，反应应在一个合理的体积中进行：一个好的起始值是 500~1000ul。
这种预清除步骤是要从裂解液中去除与 GST 成分或球珠有非特异性相互作用的蛋白质。如果相互作用的检测主要是用针对候选相互作用蛋白质的抗体，那么用 GST 或谷胱甘肽琼脂糖球珠做预淸除并不总是必需的。然而，在用 35S 标记的细胞裂解液用于确定新的蛋白质-蛋白质间相互作用时，这些步骤有助于降低本底。如果是用针对候选相互作用蛋白质的抗体来检测相互作用，包含两种对照很重要：GST 加球珠和仅有球珠。
如果相互作用的目的蛋白已知存在于专门的细胞部位. 那么探针应当与对应那种细胞部位的细胞裂解液组分孵育。
2. 在微量离心机上以最大速度在 4°C 离心混合物 2 min。
3. 将上清（就是预清除的细胞裂解液）转移到新的离心管中。
探测细胞裂解液
4. 设定两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约 10ug GST 蛋白，另一管中加约 10ug 的 GST 融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应当是等摩尔 (就是说 GST 的终浓度应当与 GST 融合探针蛋白相同）。将离心管在 4°C 翻转混合孵育 2 h。
重要：如果结合蛋白是通过煮沸而从球珠上去除（步骤 10), 那么引入仅含谷胱甘肽琼脂糖球珠和细胞裂解液的对照是重要的，它可检测到与球珠非特异性结合的蛋白质。
5. 在微量离心机上以最大速度离心样品 2 min。
6. 在新的微量离心管中收集上清。这些样品可通过步骤 10 中的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
7. 用1ml 冰冷的裂解液洗球珠。在微量离心机上以最大速度离心 1 min。弃去上清。重复洗三次。
8.(可选）加人 50ul 20 mmol/L 的还原型谷胱甘肽（在 50 mmol/LpH8.0 的 Tris-Cl 中）到球珠中，洗脱 GST 融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在微量离心机上以最大速度离心 2 min。
9. 将球珠（来自步骤 7) 或洗脱蛋白质（来自步骤 8) 与等体积的 2XSDS-PAGE 上样缓冲液混合。
检测相互作用蛋白质
10. 将样品煮沸 4 min 并做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
11. 检测与 GST 融合蛋白结合的蛋白的方法取决于细胞裂解液是否被 35S 标记以及实验的目的。
(1) 如果目的是检测与融合蛋白结合的所有 35S 标记的蛋白，就在干胶仪上将胶抽干，并用 X 线胶片曝光进行放射自显影。
(2) 如果目的是检测特异性结合的蛋白质，就将蛋白质从 SDS 聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上，进行免疫印迹分析（附录 8)。
(3) 如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液，就用考马斯亮蓝或硝酸银将胶染色（附录 8）。
相关文章
