痘苗病毒纯化实验（大规模纯化）

对于很多研究，部分纯化的病毒就足够了（进行到本实验步骤 14）， 如果是纯化 MVA 病毒，则不能用胰酶消化，也不能用 CEF 细胞或 BHK-21 细胞代替 HeLa 细胞。

1. 使用前将等体积的疸苗病毒储液和 0.25 mg/ml 的胰酶混合，用力振荡。37℃ 水浴温育 30 min，在温育过程中每隔 5～10 min 涡旋振荡一次。

2. 用血球计数器对 HeLa S3 细胞计数（附录 3F）。

3. 将 5 × 108 的 HeLa S3 细胞转移至离心管中，室温 1800 g 离心 10 min，弃上清。

4. 然后按 2 × 107 细胞/ml 的浓度用旋转摇瓶完全培养基-5 重悬细胞。

5. 按 5～8 pfu/细胞（MOI）将消化过的病毒加到细胞悬液中，搅拌温育 30 min。

6. 将细胞转移至装有 1 L 旋转摇瓶完全培养基-5 的通气旋转摇瓶中，搅拌培养 2～3 天。

7. 5～10℃，1800 g 离心 5 min，弃上清。

8. 将细胞悬浮于 14 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液中。以下步骤中样品均需置于冰上。

9. 用杜恩斯匀浆器经过 30～40 次的击打将细胞悬液均质化，通过显微镜检査细胞的破碎情况。

10. 5～10℃，300 g（H-6000A 转子中为 900 r/min）离心 5 min 以去除核，保留上清。

11. 将细胞沉淀悬浮于 3 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液。5～10℃，300 g 离心 5 min，保留上清，并与步骤 10 中的上清合并。

12. 对上清（溶解产物）进行超声处理，整个过程都应保持溶解产物低温，按照下面的步骤用杯状的超声仪进行超声。

12.1 将样品按每份 3 ml 进行分装，分别超声处理。

12.2 将杯中装满冰水混合物（50％ 的冰），将装有溶解产物的管子置于冰水混合物 中，用最大功率超声 1 min。

12.3 重复超声 3 或 4 次，每次超声后将溶解产物置于冰上 ≥ 30 s。

13. 将溶解产物加到盛有 17 ml 36％ 蔗糖垫层的无菌 SW27（或 SW28）离心管中。 4℃，32900 g 离心 80 min。将上清吸出丟弃。

14. 将病毒沉淀悬浮于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液中。到这一步纯化出的病毒对于某些用途，比如分离 DNA，其纯度已经足够了。

15. 按照步骤 12 的方法超声 1 min。

16. 在使用的前一天制备无菌的 24％～40％ 的持续蔗糖梯度，分别小心地将 6.8 ml 的 40％、36％、32％、28％ 和 24％ 的蔗糖溶液加到无菌的 SW27 离心管中。在冰箱中静置过夜。

17. 将 1 ml 超声过的病毒沉淀（来自步骤 15）加到蔗糖梯度的上层。4℃，26000 g 离心 50 min。

18. 可见乳白色的病毒带出现在离心管的中部。将病毒带以上的蔗糖溶液吸弃，小心地用无菌枪头将病毒带（约 10 ml）收集于一个无菌管中保存。

19. 将剩余的蔗糖溶液吸出后收集聚集于蔗糖梯度底部的病毒聚合物。上下抽吸将病毒沉淀重悬于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris •Cl 溶液中。

20. 按照步骤 12 的方法超声 1 min。

21. 重复步骤 16～18 的操作，收集病毒带，与步骤 18 所收集的病毒溶液合并。加入两 倍体积的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液混合，转移至无菌的 SW27 离心管中。溶液总体积应有 60 ml，足够装满两个 SW 27 离心管。如果得到的体积较少，用 1 mol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液补满离心管。

22. 4℃，32900 g 离心 60 min，吸弃上清。

23. 将病毒沉淀重悬于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液中，按照步骤 12 的方法超声，然后按每份 200～250 μl 进行分装。留一份进行步骤 24 操作，其余的冻存于 -70℃。

24. 用分光光度计在 260 nm 处对未冻存的病毒样品进行定量，以此确定提取痘苗病毒 DNA 时所需要的病毒量（见辅助方案 2）。

25. 将病毒悬液在冰上超声 20～30 s（见步骤 12），然后进行 10 倍系列稀释，直至 10-10。用 10-8、10-9 和 10-10 这 3 个稀释度去感染 6 孔板中培养的单层生长至汇片 的 BS-C-1 细胞，每个稀释度做双份。

1. 病毒储液的滴度通常为 2 × 109 pfu/ml，但不同来源的病毒储液的滴度也许会远低于这个滴度。 如果有可见的结团存在，冷却到 0℃，并在冰上超声 30 s。超声可重复数次，但两次超声之间样本应置冰上冷却。

2. 步骤 12.3 中，因为超声过程会使冰融化，所以应向杯中重新加入冰。

3. 一个光密度单位是 1.2 × 1010 个病毒颗粒，即是（2.5～5）× 108 pfu。由于光的散射、不吸光，在不同的分光光度计上这个值也许会有轻微的不同。