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DNA实验

痘苗病毒纯化实验(大规模纯化)

2024-05-30 DNA实验 加入收藏
原理对于很多研究,部分纯化的病毒就足够了(进行到本实验步骤 14), 如果是纯化 MVA 病毒,则不能用胰酶消化,也不能用 CEF 细胞或 BHK-21 细胞代


原理

对于很多研究,部分纯化的病毒就足够了(进行到本实验步骤 14), 如果是纯化 MVA 病毒,则不能用胰酶消化,也不能用 CEF 细胞或 BHK-21 细胞代替 HeLa 细胞。

材料与仪器

痘苗病毒储液 HeLa S3 细胞(悬浮培养)
胰酶 Tris • Cl 蔗糖
旋转摇瓶完全培养基-5 带紧杵的 2 L 通气旋转摇瓶 杜恩斯匀浆器(带紧杵) 杯状超声仪Beckman 超速离心机 无菌离心管(SW27 或 SW28 转头) 分光光度计

步骤

1. 使用前将等体积的疸苗病毒储液和 0.25 mg/ml 的胰酶混合,用力振荡。37℃ 水浴温育 30 min,在温育过程中每隔 5~10 min 涡旋振荡一次。


2. 用血球计数器对 HeLa S3 细胞计数(附录 3F)。


3. 将 5 × 108 的 HeLa S3 细胞转移至离心管中,室温 1800 g 离心 10 min,弃上清。


4. 然后按 2 × 107 细胞/ml 的浓度用旋转摇瓶完全培养基-5 重悬细胞。


5. 按 5~8 pfu/细胞(MOI)将消化过的病毒加到细胞悬液中,搅拌温育 30 min。


6. 将细胞转移至装有 1 L 旋转摇瓶完全培养基-5 的通气旋转摇瓶中,搅拌培养 2~3 天。


7. 5~10℃,1800 g 离心 5 min,弃上清。


8. 将细胞悬浮于 14 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液中。以下步骤中样品均需置于冰上。


9. 用杜恩斯匀浆器经过 30~40 次的击打将细胞悬液均质化,通过显微镜检査细胞的破碎情况。


10. 5~10℃,300 g(H-6000A 转子中为 900 r/min)离心 5 min 以去除核,保留上清。


11. 将细胞沉淀悬浮于 3 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液。5~10℃,300 g 离心 5 min,保留上清,并与步骤 10 中的上清合并。


12. 对上清(溶解产物)进行超声处理,整个过程都应保持溶解产物低温,按照下面的步骤用杯状的超声仪进行超声。


12.1 将样品按每份 3 ml 进行分装,分别超声处理。


12.2 将杯中装满冰水混合物(50% 的冰),将装有溶解产物的管子置于冰水混合物 中,用最大功率超声 1 min。


12.3 重复超声 3 或 4 次,每次超声后将溶解产物置于冰上 ≥ 30 s。


13. 将溶解产物加到盛有 17 ml 36% 蔗糖垫层的无菌 SW27(或 SW28)离心管中。 4℃,32900 g 离心 80 min。将上清吸出丟弃。


14. 将病毒沉淀悬浮于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液中。到这一步纯化出的病毒对于某些用途,比如分离 DNA,其纯度已经足够了。


15. 按照步骤 12 的方法超声 1 min。


16. 在使用的前一天制备无菌的 24%~40% 的持续蔗糖梯度,分别小心地将 6.8 ml 的 40%、36%、32%、28% 和 24% 的蔗糖溶液加到无菌的 SW27 离心管中。在冰箱中静置过夜。


17. 将 1 ml 超声过的病毒沉淀(来自步骤 15)加到蔗糖梯度的上层。4℃,26000 g 离心 50 min。


18. 可见乳白色的病毒带出现在离心管的中部。将病毒带以上的蔗糖溶液吸弃,小心地用无菌枪头将病毒带(约 10 ml)收集于一个无菌管中保存。


19. 将剩余的蔗糖溶液吸出后收集聚集于蔗糖梯度底部的病毒聚合物。上下抽吸将病毒沉淀重悬于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris •Cl 溶液中。


20. 按照步骤 12 的方法超声 1 min。


21. 重复步骤 16~18 的操作,收集病毒带,与步骤 18 所收集的病毒溶液合并。加入两 倍体积的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液混合,转移至无菌的 SW27 离心管中。溶液总体积应有 60 ml,足够装满两个 SW 27 离心管。如果得到的体积较少,用 1 mol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液补满离心管。


22. 4℃,32900 g 离心 60 min,吸弃上清。


23. 将病毒沉淀重悬于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris • Cl 溶液中,按照步骤 12 的方法超声,然后按每份 200~250 μl 进行分装。留一份进行步骤 24 操作,其余的冻存于 -70℃。


24. 用分光光度计在 260 nm 处对未冻存的病毒样品进行定量,以此确定提取痘苗病毒 DNA 时所需要的病毒量(见辅助方案 2)。


25. 将病毒悬液在冰上超声 20~30 s(见步骤 12),然后进行 10 倍系列稀释,直至 10-10。用 10-8、10-9 和 10-10 这 3 个稀释度去感染 6 孔板中培养的单层生长至汇片 的 BS-C-1 细胞,每个稀释度做双份。

注意事项

1. 病毒储液的滴度通常为 2 × 109 pfu/ml,但不同来源的病毒储液的滴度也许会远低于这个滴度。 如果有可见的结团存在,冷却到 0℃,并在冰上超声 30 s。超声可重复数次,但两次超声之间样本应置冰上冷却。


2. 步骤 12.3 中,因为超声过程会使冰融化,所以应向杯中重新加入冰。


3. 一个光密度单位是 1.2 × 1010 个病毒颗粒,即是(2.5~5)× 108 pfu。由于光的散射、不吸光,在不同的分光光度计上这个值也许会有轻微的不同。


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