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DNA实验

痘苗载体转染细胞实验(CaCl2 法)

2024-05-30 DNA实验 加入收藏
原理将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上,外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后,将重组质粒转染病毒感染的细胞,痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分


原理

将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上,外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后,将重组质粒转染病毒感染的细胞,痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分发生同源重组。应用适当的筛选方案,经几轮噬斑纯化,从细胞裂解物中获得重组病毒。

材料与仪器

pSCll/pRB21/pSC65/pLW9 /其他合适载体 CV-1/BS-C-1/ BHK-21 /CEF 细胞 痘苗病毒储液
完全 MEM-10 和 MEM-2.5 培养基 转染缓冲液 干冰/乙醇 胰酶 CaCl2
25 cm2 组织培养瓶 聚苯乙稀管 刮刀/橡皮细胞刮刀 15 ml 无菌锥形离心管 Sorvall 离心机

步骤


1. 将目的基因亚克隆到 pSC11、pRB21、pSC65、pLW9 或其他合适载体的多克隆位点(MCS)上,分离质粒。


2. 将 1 × 106 的 CV-1、BS-C-1,BHK-21 或 CEF 细胞用完全 MEM-10 培养基接种到 25 cm2 组织培养瓶中,培养至接近单层生长至汇片的程度(通常过夜)。


3. 使用前,将等体积的痘苗病毒储液与 0.25 mg/ml 胰酶混合,涡旋混匀。在 37℃ 水浴锅中保温 30 min,并在保温过程中每隔 5~10 min 涡旋混匀一次。对于 MVA, 以在冰上超声 30 s 打散病毒团块代替胰酶解。病毒储液的滴度常常在 2 × 109 pfu/ml 左右,但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。


4. 用完全 MEM-2.5 培养基将病毒稀释到 1.5 ×107 pfu/ml。在汇片生长的单层细胞培养瓶中吸出培养基,加入 1 ml 稀释的病毒(0.05 pfu/细胞)转染。培养 2 h,每隔 15 min 轻轻摇动一次。在转染结束前 30 min,按照下面介绍的方法制备 DNA。


5. 在 12 mm × 75 mm 聚苯乙稀管中加入 1 ml 的转染缓冲液,再加入 5~10 μg(<50 μl)含有目的基因的重组质粒(来自步骤 1)。



6. 缓慢地加入 50 μl 2.5 mol/L CaCl2,并轻轻混合均匀,在室温放置 20~30 min,细小的沉淀应该会出现。


7. 从单层细胞吸去病毒接种物(步骤 4)。


8. 将沉淀的 DNA 悬液(步骤 6)加入细胞,室温放置 30 min,然后加入 9 ml 完全 MEM-10 培养基 37℃ 培养 3~4 h。


9. 吸出培养基,加入 5 ml 完全 MEM-10 培养基,37℃ 培养 2 天。


10. 用刮刀或无菌的橡皮细胞刮刀,轻轻刮下细胞,转移到 15 ml 锥形离心管中,5~10℃,1800 g 离心 5 min,弃培养基。


11. 将细胞用 0.5 ml 完全 MEM-2.5 培养基重悬。反复冻融裂解细胞悬液:用干冰/乙醇冷冻使细胞冻结,37℃ 水浴及涡旋将细胞解冻。如此进行 3 次。


12. 将细胞裂解物置 -70℃ 保存,直至筛选步骤进行(见「重组病毒噬斑筛选实验」)。

注意事项

1. 所有步骤必须在生物安全柜中进行无菌操作。



2. 培养都在加湿的 5% CO2 培养箱中 37℃ 培养,除非有特殊说明。


3. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的。


4. 在转染中不需要包含痘苗病毒 DNA,但加入可以导致高效率的重组。如果要加入,1 μg 痘苗病毒 DNA 混合 5~10 μg 重组质粒 DNA,在加入 CaCl2 前,涡旋混匀以切割大分子质量的 DNA。


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