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DNA实验

用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的 RNA

RNA
2024-06-01 DNA实验 加入收藏
原理在提取过程的第一阶段细胞的 RNA 酶应尽快灭活。一旦内源的 RNA 酶被破坏,RNA 受损的可能就大大降低,而纯化的过程就可以按合适的速度进行。材料与仪器


原理

在提取过程的第一阶段细胞的 RNA 酶应尽快灭活。一旦内源的 RNA 酶被破坏,RNA 受损的可能就大大降低,而纯化的过程就可以按合适的速度进行。

材料与仪器

细胞和组织
氯仿 乙醇 异丙醇 液氮 苯酚 磷酸缓冲盐溶液 PBS 乙酸钠 溶液 D(变性液)
比色杯 组织匀浆器 研棒和研钵 聚丙烯管 水浴

步骤

一、材料

1. 溶液与缓冲液

氯仿:异戊醇(49:1,V/V)

乙醇

异丙醇

液氮

苯酚

磷酸缓冲盐溶液 PBS(仅供悬浮细胞和单层细胞用)

乙酸钠(2 mol/L,pH 4.0)

溶液 D(变性液)



去离子甲酰胺(可选)

细胞和组织

2. 离心与转子

Sorvall SS-34 (或与之相当的转子);Sorvall H1000 (或与之相当的转子)

3. 专用设备

测 260 nm 吸光率的比色杯

组织匀浆器

用 DEPC 水处理过、预冷的研棒和研钵

聚丙烯管

65℃ 水浴

二、方法

1. 选取从组织或细胞中提取 RNA 的适宜方法

(1) 组织

① 分离组织并立即置于液氮中。

② 将约 100 mg 冰冻组织含液氮的研钵中,用研棒研磨。研磨过程中可加入液氮使组织保持冰冻状态。

③ 将组织碎末移入含 3 ml 溶液 D 的管中。

④ 用搅拌子室温下搅拌组织 15~30 s。

(2) 哺乳动物悬浮细胞

① 室温下 200~1900 g 离心 5~10 min (1000~3000 r/min 用 Sorvall RT600, H1000 转子)收获细胞。

② 吸出培养基将细胞重悬于 1~2 ml 冰预冷的 PBS 中。

③ 离心收获细胞,彻底吸尽 PBS, 每 106 细胞加 2 ml 溶液 D。

④ 用搅拌子室温下搅拌细胞 15~30 s。

(3) 哺乳动物单层培养细胞

① 吸出培养基用 5~10 ml 冰冷的 PBS 洗细胞一次。

② 吸出 PBS 加入溶液 D 覆盖细胞,90 mm 培养皿加 2 ml ( 60 mm 培养皿加 1 ml)。

③ 将细胞溶解物移至管中。

④ 用搅拌子室温下搅拌溶解细胞 15~30 s。

2. 将混合物移至一管中,在每毫升溶液 D 中立即加入 0.1 ml 2 mol/L 的醋酸钠 ( pH 4.0),1 ml 酚,0.2 ml 氯仿-异戊醇。加入每种组分后,盖上管盖,倒置混匀。

3. 将匀浆剧烈振荡 10 s。冰浴 15 min 使核蛋白质复合体彻底裂解。

4. 10000 g ( 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子)4℃ 离心 20 min, 将上层含 RNA 的水相移入一新管中。

5. 加入与提取的 RNA 等量的异丙醇。充分混合液体,并在 -20℃ 沉淀 RNA 1 h 或更长时间。

6. 10000 g ( 9000 r/min 用 Sorvall SS-34 转子)4℃ 离心 30 min, 收集沉淀的 RNA。

7. 轻轻倒出异丙醇加入溶液 D 溶解 RNA 颗粒,每 1 ml 第一步所使用的溶液加 0.3 ml 溶液 D。

8. 将溶液移至一微量离心管,涡旋混匀,并在 -20℃ 用等量异丙醇沉淀 RNA 1 h 或更长时间。

9. 在微量离心机上,于 4℃ 最大速离心 10 min 收集 RNA 沉淀。用 75% 的乙醇洗涤沉淀 2 次,重复离心。用一次性使用的吸头吸出残存的乙醇。将打开盖的离心管在实验台放置几分钟,以便乙醇蒸发。RNA 不可完全干燥。

10. 加 50~100 μl DEPC 处理过的水。将 RNA 溶液贮存于 -70℃。

11. 估计 RNA 的浓度。




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