用固化 Ni2+吸收色谱纯化带组氨酸标签的蛋白实验
材料与仪器表达带多聚组氨酸标签的蛋白的大肠杆菌细胞结合缓冲液 咪唑洗脱缓冲液 TritonX-100洗涤缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶Sorvall SS-34
材料与仪器
表达带多聚组氨酸标签的蛋白的大肠杆菌细胞
结合缓冲液 咪唑洗脱缓冲液 TritonX-100洗涤缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
Sorvall SS-34 转头或相当的转头 层析柱固化 Ni2+层析树脂 摇床
结合缓冲液 咪唑洗脱缓冲液 TritonX-100洗涤缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶
Sorvall SS-34 转头或相当的转头 层析柱固化 Ni2+层析树脂 摇床
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
结合缓冲液（pH7.8)
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
咪唑洗脱缓冲液（pH6.0)
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
在洗涤缓冲液（pH6.0) 中加入适量 3mol/L 咪唑分别配成 10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L 和150 mmol/L 的咪唑洗脱缓冲液。
TritonX-100(10%V/V)
洗涤缓冲液（pH6.0）
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
酶和缓冲液
DNase(1 mg/ml)
溶菌酶
RNase（1 mg/ml)
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%）
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
离心机和转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
层析柱（玻璃或聚丙烯）
固化 Ni2+层析树脂（如 ProBond,Invitrogen 公司；HisTrap,Pharmacia 公司；His.Bind Resin,Novagen 公司；NTA-Ni2+-琼脂糖，Qiagen 公司）
目前最常用的金属螯合亲和载体是次氨基兰乙酸酯（NTA)-Ni2+-琼脂糖，可从上述公司购买，另外还有不同性质的其他载体。据说一种独特的 Co2+螯合物（Talon) 对 His-6 的亲合力更高，选择性也更强,但在实验室再生不方便. 因此成本也就更高。
摇床
载体和细菌菌株
表达带多聚组氨酸标签的蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1、2、3 或 4 产生）。
方法
Ni2+亲和柱的制备
1. 轻轻颠倒混匀固化 Ni2+树脂，取 2 ml 装入层析柱，树脂自然沉降。
2. 用 3 倍柱体积的无菌水冲洗树脂。
树脂沉降后的体积为 1 个柱体积。
3. 用 3 倍柱体积的结合缓冲液（pH7.8) 平衡树脂，放置待第 9 步使用。
制备细胞抽提物
4. 每 100 ml 细胞培养物的细胞沉淀（方案 1 步骤 17) 悬于 4 ml 结合缓冲液（pH7.8)。
5. 加入溶菌酶至终浓度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在亲和纯化带组氨酸标签蛋白之前，采用超声或 French 压的方法裂解细胞。使用溶菌酶的方法重复性更好，而且不会引起细胞的灾难性裂解，后者释放外膜蛋白和能引起带组氨酸标签蛋白聚集的其他分子。
注意：可以加入蛋白酶抑制刑，但不能加入 EDTA 或其他螯合剂，因为它们会将 Ni2+从树脂上带下来. 破坏树脂对组氨酸的亲合力。
6. 混和物于 4°C 摇床上孵育 10 min。
7. 加入 Triton X-100、DNase 和 RNase, 终浓度分别为 1%、5ug/ml 和 5ug/ml，再于 4°C 摇床上孵育 10min。
8.4°C 3000 g(5000 r/min Sorvall SS-34 转头）离心 30 min, 去除不溶性细胞碎片。上清（细胞裂解物）转移到一只新管中。
为防止纯化过程中树脂被堵塞, 上淸需要用 0.45 滤膜过滤。
纯化带组氨酸标签蛋白
9. 树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10. 步骤 8 获得的细胞裂解液上清上柱，流速调整为每小时 10 个柱体枳。
1 ml Ni2+亲和树脂能结合大约 8~12 mg 蛋白。带多聚组氨酸标签的蛋白在大肠杆菌中的产量因靶蛋白而异，但一般都在每 100 ml 培养物蛋白之间 。
11. 用 6 个柱体积的结合缓冲液（pH7.8) 洗柱。
12. 用 4 个柱体积的洗涤缓冲液（pH6,0) 洗柱，直至流过液 A280<0.01。
13. 用 6 个柱体积的 10 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，每份 1 ml 分步收集，监测 A280。
14. 用咪唑浓度更高（50 mmol/L、100 mmol/L 和 150 mmol/L) 的洗脱缓冲液重复步骤 13。
也可用 10~100 mmol/L 连续梯度咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，多数组氨酸标签蛋白在 50~100 mmol/L 之间被洗脱。如果不使用咪唑，还可以用 pH 递降的缓冲液洗脱（请参考替代方案：用 pH 递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱多聚组氨酸标签蛋白）。
15. 用 20ul 等份的蛋白进行 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
结合缓冲液（pH7.8)
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
咪唑洗脱缓冲液（pH6.0)
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
在洗涤缓冲液（pH6.0) 中加入适量 3mol/L 咪唑分别配成 10 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L 和150 mmol/L 的咪唑洗脱缓冲液。
TritonX-100(10%V/V)
洗涤缓冲液（pH6.0）
20 mmol/L 磷酸钠
500 mmol/LNaCl
酶和缓冲液
DNase(1 mg/ml)
溶菌酶
RNase（1 mg/ml)
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%）
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
离心机和转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头
特别配备
层析柱（玻璃或聚丙烯）
固化 Ni2+层析树脂（如 ProBond,Invitrogen 公司；HisTrap,Pharmacia 公司；His.Bind Resin,Novagen 公司；NTA-Ni2+-琼脂糖，Qiagen 公司）
目前最常用的金属螯合亲和载体是次氨基兰乙酸酯（NTA)-Ni2+-琼脂糖，可从上述公司购买，另外还有不同性质的其他载体。据说一种独特的 Co2+螯合物（Talon) 对 His-6 的亲合力更高，选择性也更强,但在实验室再生不方便. 因此成本也就更高。
摇床
载体和细菌菌株
表达带多聚组氨酸标签的蛋白的大肠杆菌细胞（方案 1、2、3 或 4 产生）。
方法
Ni2+亲和柱的制备
1. 轻轻颠倒混匀固化 Ni2+树脂，取 2 ml 装入层析柱，树脂自然沉降。
2. 用 3 倍柱体积的无菌水冲洗树脂。
树脂沉降后的体积为 1 个柱体积。
3. 用 3 倍柱体积的结合缓冲液（pH7.8) 平衡树脂，放置待第 9 步使用。
制备细胞抽提物
4. 每 100 ml 细胞培养物的细胞沉淀（方案 1 步骤 17) 悬于 4 ml 结合缓冲液（pH7.8)。
5. 加入溶菌酶至终浓度 1 mg/ml, 冰上放置 30 min。
有些方案中在亲和纯化带组氨酸标签蛋白之前，采用超声或 French 压的方法裂解细胞。使用溶菌酶的方法重复性更好，而且不会引起细胞的灾难性裂解，后者释放外膜蛋白和能引起带组氨酸标签蛋白聚集的其他分子。
注意：可以加入蛋白酶抑制刑，但不能加入 EDTA 或其他螯合剂，因为它们会将 Ni2+从树脂上带下来. 破坏树脂对组氨酸的亲合力。
6. 混和物于 4°C 摇床上孵育 10 min。
7. 加入 Triton X-100、DNase 和 RNase, 终浓度分别为 1%、5ug/ml 和 5ug/ml，再于 4°C 摇床上孵育 10min。
8.4°C 3000 g(5000 r/min Sorvall SS-34 转头）离心 30 min, 去除不溶性细胞碎片。上清（细胞裂解物）转移到一只新管中。
为防止纯化过程中树脂被堵塞, 上淸需要用 0.45 滤膜过滤。
纯化带组氨酸标签蛋白
9. 树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10. 步骤 8 获得的细胞裂解液上清上柱，流速调整为每小时 10 个柱体枳。
1 ml Ni2+亲和树脂能结合大约 8~12 mg 蛋白。带多聚组氨酸标签的蛋白在大肠杆菌中的产量因靶蛋白而异，但一般都在每 100 ml 培养物蛋白之间 。
11. 用 6 个柱体积的结合缓冲液（pH7.8) 洗柱。
12. 用 4 个柱体积的洗涤缓冲液（pH6,0) 洗柱，直至流过液 A280<0.01。
13. 用 6 个柱体积的 10 mmol/L 咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，每份 1 ml 分步收集，监测 A280。
14. 用咪唑浓度更高（50 mmol/L、100 mmol/L 和 150 mmol/L) 的洗脱缓冲液重复步骤 13。
也可用 10~100 mmol/L 连续梯度咪唑洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白，多数组氨酸标签蛋白在 50~100 mmol/L 之间被洗脱。如果不使用咪唑，还可以用 pH 递降的缓冲液洗脱（请参考替代方案：用 pH 递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱多聚组氨酸标签蛋白）。
15. 用 20ul 等份的蛋白进行 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。
常见问题
本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。
