第一章 色谱法概论  1

       第一节 色谱法发展简史  1
       第二节 色谱法中的一些术语  3
       第三节 色谱法的分类  3
       一 、根据分离的原理不同进行分类  3
       二 、根据流动相的不同进行分类  4
       三 、根据支持物的装填方式分类  5
       第四节 不同色谱法的应用范围  5
       第五节 色谱图的一些术语  6
   第二章 蛋白质液相色谱纯化概论  6
       第一节 蛋白质纯化的一般目标和方法  6
       第二节 液相色谱纯化前的预备工作  7
       一 、样品的稳定性实验  7
       二 、样品的预处理及保存  7
       三 、评价每一纯化步骤：  9
       第三节 蛋白质色谱纯化技术理论简介  9
       一 、可以用于分离的目的蛋白性质  9
       二 、蛋白质的来源  10
       三 、常用色谱技术原理简介  10

       第一章 色谱法概论

       第一节 色谱法发展简史
色谱法(chromatography)又称为层析法、色层分离法。早在1906年，俄国植物学家M. Tswett在研究植物叶绿素时发现不同的色素可被CaCO3吸附，并在用石油醚洗脱时得到分离，这是最原始的液-固色谱法。
但在此后的30年中，Tswett的方法并未得到人们的注意，直到1931年R. Kuhn等人用此种方法将叶黄素成功得分离为黄体素和玉米黄质素两种成分，色谱法才受到人们的重视。以后，许多人对Tswett的方法进行了一系列的基础研究工作，并对吸附剂、操作装置和方法进行了大量改进。在很短的时间里，色谱法在有机化学、无机化学、生物化学等领域得到了广泛的应用，
1941年A.J.P. Martin和R.L.M. Synge使用含有一定量水的硅胶作为固定相，以氯仿作为流动相对氨基酸混合物进行了成功的分离。由于此种分离方法的原理与Tswett的方法完全不同，Martin将此种分离方法称为分配色谱法。同时，Martin与Synge提出了液-液分配色谱的塔板理论，为色谱法奠定了坚实的理论基础。目前塔板理论已被广泛用于阐明气相色谱、离子交换色谱和高效液相色谱等色谱方法的分离机理。
1944年，Martin与其同事R. Consden、A.H. Gordon等用滤纸代替硅胶，成功得分离了不同的氨基酸。这种方法被称为纸色谱（纸层析），并在氨基酸、糖类、肽类、抗生素的分立中具有重要作用。
1947年Boyd等人公布了一系列应用离子交换色谱分离裂变产物和稀土元素混合物的论文，引起了人们的极大关注。由于许多化学家和生物化学家的多年努力，现在离子交换色谱法已经成为分析、分离各种无机离子和有机离子以及蛋白质、核酸、多糖之类的生物大分子的极其重要的手段。
1949年，Maclean和Hall将淀粉粘合剂引入氧化铝吸附剂中，促成薄层色谱法（TLC, thin-layer chromatography）的出现。
50年代初期，Cremer、James和Martin开始利用溶质在气相和液相之间的分配来分离物质，称为气相色谱法，并很快在石油、化学、化工、有机合成、医药食品等工业生产和科研中得到了广泛的应用。目前已逐渐形成一个专门的学科领域—气相色谱学。
到了60年代后半期，在气相色谱的启发下，人们用增加压力以提高流速，降低装填物粒度和改进支持物和固定液的性质以提高分辨率的办法，使得经典的液相色谱向着快速、高效的方向发展，出现了高效液相色谱（又称高压液相色谱）（HPLC, high performance liquid chromatography； high pressure liquid chromatography）。目前高效液相色谱在分离速度和分离效率上可以和气相色谱媲美，而且各种型号的高效液相色谱仪相继推出，这使得液相色谱成为应用范围更广泛的分析、分离工具。
现在，为了解决科学研究和生产中的各种分析、分离问题，色谱法和其他技术的应用愈来愈普遍。例如：气相色谱和质谱联用，气相色谱和红外光谱联用，液相与紫外，液相与质谱，色谱法和电泳技术联用等。

          第二节 色谱法中的一些术语
在Tswett的实验中，装柱所用的碳酸钙是一种吸附剂，色谱法中称为固定相；把大分离的样品加到柱上的操作称为加样或者上样；用合适的溶剂冲洗柱子，使样品分离的操作称为洗脱；洗脱用的溶剂称为洗脱剂；以洗脱液的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标左图，该图形称为洗脱曲线或色谱图。
色谱法的经典定义是溶质在流动相和固定相之间进行分配来达到分离的方法。对于优先在流动相分配的物质比优先在固定相分配的移动得快些。

          第三节 色谱法的分类
一、根据分离的原理不同进行分类
1、吸附色谱
用吸附剂为固定相的色谱称为吸附色谱。
2、分配色谱
根据两相同时存在的系统中，不同物质的分配系数不同而设计的色谱方法。
3、离子交换色谱
它的固定相是离子交换剂，离子交换剂上有许多可以解离的基团。离子交换剂上可解离基团解离后，留在母体上为阳离子者为阴离子交换剂，反之为阳离子交换剂。阴阳离子交换剂分别可以和溶液中的阴阳离子发生离子交换。由于不同的离子在离子交换剂上的交换能力不同，当进行洗脱时，各自迁移的速度也不相同，从而得到分离。
4、凝胶过滤色谱（分子筛色谱、排阻层析）
使用具有一定大小孔径的凝胶颗粒为支持物的色谱方法。这是一种根据分子大小进行分离的色谱方法。
5、亲和色谱
根据生物大分子与其配体（酶与其抑制剂、抗体与抗原、激素与其受体）通过次级键特异结合，而在一定条件下可以解离的特点，将与分离的生物大分子的配体通过化学反应偶联到某种载体上，便可以专一性得吸附该生物大分子，一步便可以将要分离的物质纯化得较纯。
6、共价色谱
利用蛋白质分子表面游离的巯基与介质共价结合。
二、根据流动相的不同进行分类
1、气相色谱法（GC）
流动相为气体的称为气相色谱。根据固定相的不同又分为气-固色谱法（GSC）和气-液色谱法（GLC）。
2、液相色谱法
凡流动相为液体的皆为液相色谱。根据固定相的不同又进一步分为液-液色谱法（LLC）和液-固色谱法（LSC）。
3、临界状态色谱法（CSC，critical-state chromatography）
流动相是临界状态液体（气体）。并又进一步分为临界状态固体色谱法（CSSC）和临界状态液体色谱法（CSLC）。
三、根据支持物的装填方式分类
支持物装在管中呈柱形，在柱中进行的称为柱色谱；支持物铺在玻璃板上呈薄层的，称为薄层色谱。根据所用支持物种类的不同，在柱或薄层上进行的色谱可以是吸附色谱，也可以是分配色谱或者离子交换色谱。

         第四节 不同色谱法的应用范围
气-固色谱法
使用硅胶、氧化铝或分子筛作为固定相的气固色谱，几乎全部用于永久性气体和低沸点烃类的分析中。
气-液色谱法
用于分离稳定而没有过高极性的挥发性物质。通过形成低极性的衍生物以及在某些情况下使用特殊的吸附剂，也在分离一些高极性物质方面取得了一些成功。
临界状态色谱法
多用于分离多核芳烃和氯代烃。
薄层色谱法
在生物化学领域有广泛的应用，范围从类脂类化合物、脂溶性染料、多核芳烃到肽和氨基酸的分离。
纸色谱法
几乎局限于蔗糖、核苷酸、多肽和无机离子的分离。
液-固色谱法
用于氨基酸、多核芳烃、和高分子量、高极性物质的分离中。
液-液色谱法
需在载体物质上获得一个持久的固定相涂层，现多采用以化学键键和在载体表面的具有液相特征的“键和相”。

        第五节 色谱图的一些术语
峰高：色谱峰的最高点到基线（baseline）的距离。
峰宽：0.6065峰高处的峰宽度。
峰底的峰宽：作在拐点处与色谱峰相切的两条直线，它们与基线相交的两点之间的距离称为峰底的峰宽。
半峰高处峰宽：半峰高处的峰宽度。
保留时间：从进样到峰最大值所用的洗脱时间。
保留体积：从进样到峰最大值所用的洗脱体积。
分辨率：色谱图上两个峰最大值之间的距离，与它们各自在0.6065峰高处峰宽的和的比值。

       第二章 蛋白质液相色谱纯化概论

       第一节 蛋白质纯化的一般目标和方法
首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
然后进行捕获色谱（capture chromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用的高载量、快流速凝胶和阶段洗脱的方法。
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediate chromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶，采用梯度洗脱进行。
最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者分解片断，进行精制色谱（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。

       第二节 液相色谱纯化前的预备工作
一、样品的稳定性实验
在大多数情况下，需要在色谱纯化后保持蛋白质的生物活性，而且蛋白质的变性会导致蛋白质在色谱柱中沉积、增强非特异吸附，所以在色谱纯化过程中应当在样品的稳定范围内进行。所以在设计色谱分离程序之前，应该先对样品进行一系列的稳定性实验。
1、测定样品在pH 2-9之间的稳定性。
2、测定样品对高盐浓度的稳定性。NaCl，0-4 mol/L，(NH4)2SO4，0-2 mol/L。
3、测定样品在有机溶剂下的稳定性，0-50% 乙腈或甲醇。
4、测定样品对温度的敏感性，4-40℃。
5、测定样品对于蛋白水解的稳定性，室温下静置过夜。
二、样品的预处理及保存
1、样品处理的一般原则
在进行色谱分离之前，要除去样品中对于色谱柱有害及对样品稳定不利的杂质。
表格 1 样品中有害杂质及消除办法
杂质  害处  预防措施
颗粒物  堵塞柱子  0.45-0.22微米膜过滤；10000 g 离心10-15分钟；细胞匀浆，4000-5000 g离心30分钟。
脂类  封闭介质配基、导致沉淀、导致非特异吸附  10000 g离心10-15分钟；若目标分子稳定，用有机溶剂抽提
核酸  高粘度、封闭介质结合位点  加入核酸酶消化，或使核酸沉淀
蛋白酶  降解目的蛋白  加入蛋白酶抑制剂；用亲和色谱除去蛋白酶；快速进行第一步分离；低温下进行分离；在蛋白酶缺陷的宿主中表达重组蛋白
2、对特定的色谱步骤的样品处理
由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。如下表所示：
样品参数  离子交换色谱  疏水作用色谱  凝胶过滤色谱
样品体积  无限制  无限制  一般柱体积的1-5%
样品量  最大理论载量的10-20%  最大理论载量的10-20%  仅受到样品粘度限制
样品粘度  约<50mg/ml  约<50mg/ml  约<50-100mg/ml
pH值／盐浓度  同平衡缓冲液  同平衡缓冲液  仅受介质与样品稳定性限制
有机溶剂  为减少非特异吸附,可加入有机溶剂(<30%)    仅受介质与样品稳定性限制

3、样品的保存条件
短期储存（小于24小时）
1） 避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀
2） 在密闭容器中冰箱冷藏
较长期储存（数天）
1）2）同上
3） 加入适当的抑菌剂
长期储存
1） 同上
2） 冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
三、评价每一纯化步骤：
1、测定靶蛋白含量的技术
1） 酶活性测定
2） 生物活性测定
3） RIA（放射免疫），ELISA（酶联免疫）
4） 免疫电泳
5） 荧光
6） 质谱，精确测定分子量(<100kD)
2、总蛋白含量测定技术
1） 紫外吸收
2） Lowry法
3） Bradford 染料结合法(考马斯亮兰G-250)
3、样品复杂度检测技术
1） 分析型离子交换色谱
2） 分析型反相色谱（小蛋白、多肽）
3） SDS-PAGE
4） 等电聚焦
5） 毛细管电泳
6） 分析型凝胶过滤色谱

        第三节 蛋白质色谱纯化技术理论简介
一、可以用于分离的目的蛋白性质
在大多数情况下，色谱分离在非变性条件下进行，这样，不同蛋白质表面静电荷、表面疏水性、分子大小的差异是最广泛应用的离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶过滤色谱的基础。
亲和色谱利用了靶蛋白与特定配基的特异性作用力进行分离。比如：抗原-抗体，酶-底物，酶-抑制剂，植物凝集素-糖蛋白等。
二、蛋白质的来源
1） 天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
2） 重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：
细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
来源  目的蛋白含量  复杂度  杂质类型  色谱前预处理
天然  低  复杂  固体颗粒，杂蛋白，核酸，蛋白酶  去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶
重组  细胞质  较高  复杂  细胞碎片，宿主蛋白，核酸，蛋白酶  去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶
  包涵体  很高  低，主要为目的蛋白    高速离心分离，溶解、复性
  外周质  高  中等  宿主蛋白，蛋白酶  去除固体颗粒
  分泌  低  低，主要含培养基蛋白  培养基，蛋白酶，宿主蛋白  去除固体颗粒，抑制蛋白酶
三、常用色谱技术原理简介
1、 离子交换色谱
离子交换色谱利用固定在基质上的带电荷基团可逆吸附带相反电荷的样品分子，并通过pH梯度或者盐梯度洗脱。
根据吸附基团带电荷不同，可以分为阴离子交换、阳离子交换两大类，并根据吸附基团作用的pH范围的宽窄可细分为：强阴离子（Q，QAE）、弱阴离子(DEAE)、强阳离子(S，SP)、弱阳离子(CM)，此处强弱并不代表对蛋白质吸附作用的强弱。
影响离子交换的主要因素是缓冲液pH值，梯度也有较大的影响，
一般原则：
1） 对于等电点<5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换色谱；而对于等电点>7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换色谱；对于弱酸性或中性蛋白质，可以试用任一种离子交换色谱。
2） 对于阴离子交换色谱，缓冲液pH值至少比目的蛋白质等电点高1个pH单位；对于阳离子交换，缓冲液pH值至少比目的蛋白等电点低1 个pH单位。
3） 可以先试用0-0.5 mol/L NaCl线性梯度洗脱。
2、 凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱是根据分子大小分离的一种技术。
选择适当分离范围的凝胶，可以很好地分离分子量相差两倍的不同蛋白质。
影响凝胶过滤分离效果的主要因素有：凝胶分离范围是否合适，色谱柱装填的好坏，上样体积、流速等。小的上样体积和较小的流速可以改善凝胶过滤的分离效果。
凝胶过滤色谱对于缓冲液选择无严格要求，但一般应有0.1-0.15 mol/L的盐浓度，以减少凝胶对蛋白质的非特异吸附。
除了分离蛋白质之外，凝胶过滤还广泛应用于蛋白质样品的脱盐或者更换缓冲液，在这种条件下，常使用Sephdex G25凝胶，上样量可以达到柱体积的25%左右。