原位杂交操作规程

一、仪器设备

医用微波炉； 水浴锅。

二、试剂

0.2 mol/L HCl：HCl 8.2 ml，H2O 定容0.5 L。

0.1 mol/L 三乙醇胺(pH8.0)：三乙醇胺 5.33 ml，H2O 定容0.4 L。

0.5 ml/L 醋酸-2.5 ml/L 醋酸酐：三乙醇胺 13.2 ml，NaCl 5 g，浓HCl 4 ml，H2O 定容0.98 L，醋酸酐 （用前加）2.5 ml。

20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3 g，枸橼酸钠 88.2 g，H2O定容1 L。

100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1 g，BSA 1 g，H2O 定容50 ml。

杂交液：Formamide 5 ml，20×SSC 2.5 ml，Dextran sulfate 1 g，100×Denhardt's 0.5 ml，10%SDS 0.5 ml，10 g/L sperm DNA 0.1 ml，H2O 1.4 L。

BufferⅠ（pH7.5）：0.1 mol/L ris·Cl，0.15 mol/L NaCl。

BufferⅢ（pH9.5）：0.1 mol/L Tris·Cl，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl2。

BufferⅣ（pH8.0）：10 mmol/L Tris·Cl，1 mmol/L EDTA。

三、操作流程

1. 使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天。 （1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； （2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； （3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； （4） PBS清洗3分钟； （5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； （6） PBS清洗10分钟； （7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； （8） PBS清洗2次，每次3分钟； （9） 0.2N的HCl孵育30分钟； （10）PBS清洗2次，每次3分钟； （11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； （12）PBS清洗2次，每次5分钟； （13）预杂交缓冲液孵育30分钟；