Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > DNA实验

DNA实验

用碱性磷酸酶启动子和信号序列分泌表达外源蛋白实验

2024-06-03 DNA实验 加入收藏
最新修订时间:2024-05-13材料与仪器大肠杆菌菌株 pTA1529 或 pBAce 阳性对照质粒考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 微量营养 MOPS 盐 中性

最新修订时间:

材料与仪器

大肠杆菌菌株 pTA1529 或 pBAce 阳性对照质粒
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液 微量营养 MOPS 盐 中性磷酸盐缓冲液 SDS 凝胶加样缓冲液 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 靶基因或 cDNA 片段 诱导培养基 LB 琼脂平板 LB 培养基
Sorvall GSA 转头或相当的转头 Sorvall SS-34 转头或相当的转头 沸水浴

步骤

材料

缓冲液和溶液

贮存液,缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。

考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录 8。

微量营养(用于 10xMOPS 盐)

37 mg(NH4)6Mo7O24•4 H2O
84 mgCoCl2
158 mgMnCl2•4 H20
247 mgH3BO3
25 mgCuSO4
18 mgZnSO4
溶于10ml 终体积,过滤除菌,贮存于 4°C。

10XMOPS 盐(用于诱导培养基)

400 mmol/L3-(N-吗啉代) 丙磺酸(pH7T4)(MOPS)
40 mmol/L 麦黄酮 (pH7.4)
0.1 mmol/L FeSO4•7 H2O
95 mmol/LNH4Cl
2.8 mmol/LK2SO4
5umol/LCaCl2•2 H2O
5.3 mmol/LMgCl2•6 H2O
0.5mol/NaCl
溶于 1L 终体积,过滤除菌. 用前每升加 10ul 微量营养。

中性磷酸盐缓冲液(1mol/L)(用于诱导培养基)
1 mmol/LNa2 HPO4 和 1 mmol/L NaH2PO4 等摩尔灌合。

1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存,1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。

凝胶

SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶制备参考附录 8。

核酸和寡核苷酸

靶基因或 cDNA 片段

培养基

诱导培养基

1xMOPS 盐 (配方见上)
0.2%(m/V) 葡萄糖
0.2%(m/V) 酪蛋白水解物(维生素分析级;DIFCO 公司)
20ug/ml 腺嘌呤
0.5ug/ml 硫胺
0.1mol/L 中性磷酸盐缓冲液(配方见上)
由各自贮存液混合配成 1 升水溶液,过滤除菌,贮存于 4°C。
诱导 phoA 的低磷酸盐培养基 (Neidhardt et al,1974; 最初用于同位素标记)虽然配制麻烦,担总能获得最高水乎的诱导。

含氨苄(50ug/ml) 的 LB 琼脂平板

含氨苄(50ug/ml) 的 LB 培养基

离心机和转头

Sorvall GSA 转头或相当的转头
Sorvall SS-34 转头或相当的转头

特别配备

沸水浴

补充试剂
本方案步骤 1 需要笫 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。

载体和细菌菌株

大肠杆菌菌株
任何大肠杆菌菌株都可用作载体的宿主。Oka 等(1985)报道外源蛋白在 YK537 中比在 C600 中表达量髙 5 倍,YK537 菌株带有内部缺失突变的如 phoA 基因,但表达水平的差异可能并不是由突变造成的,因为 B.L.Wanner(个人通信)等发现外源蛋白在同基因野生型或 phoA8 菌株中的表达没有差异。如果外湎蛋白没有毒性,就可以使用带 phoR 突变的细菌菌株。因为野生型 phoR 基因编码操纵子的阻抑物,phoR 突变株组成表达/启动子控制的基因(Wanner1987)。对于所有的细菌表达系统可能都需要试用不只一种宿主,才能找到最适于表达特定外源蛋白的大肠杆菌菌株(Weikert et al.1988)。不同的菌株也应在不同的溫度培养,以获得最高表达水平和蛋白稳定性(见方案 1)。

pTA1529 或 pBAce
质粒 pTAl529 由 Oka 等(1985) 构建;pBAce 由 C.C.Wang(Department of Pharmaceutical Chemistry,University of Caliafornia,SanFrancisco) 构建。

阳性对照质粒(表达已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 诱导载体)

方法

含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建

1.PCR 修饰或限制性内切酶消化分离 DNA 片段,片段 5'端和 3'端带有与 pTA1529 或 pBAce 对应的限制酶位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变,应对 PCR 产物进行序列分析。

2. 含靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接(第 1 章方案 17 或 19)。

3. 连接产物转化适当的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含氨苄(50ug/ml) 的 LB 平板,于 37°C 过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。

4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体(请参见第 12 章方案 3)。

诱导靶蛋白表达的优化

许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。

5. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落,接入 lml 含氨苄青霉素(50ug/ml) 的 LB 培养液,37°C 培养过夜。

6. 取 50ul 接入 5 ml 含氨苄青霉素(50ug/ml) 的诱导培养液,20~37°C 振荡培养。
影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。

7. 接种后不同时间(如 0、6、12、18 和 24 h) 取 1 ml 样品放于微量离心管中,测定 A550, 室温高速离心 1 min。
phoA 启动子的诱导比其他启动子慢,因为诱导是随着培养基中磷黢盐的不断消耗而发生的。最佳生长溫度也因表达蛋白而异,必须通过实验确定。

8. 沉淀悬于 100ul lxSDS 凝胶加样缓冲液,100°C 加热 3 min, 室温高速离心 1 min, 冰上放置,待全部样品处理完后上样。

9. 样品加热至室温,取 40ug 或相当于 0.15OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。

10.8~15V/cm 电泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。

11. 考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带(见附录 8)。
如果用 phoA 信号肽引导外源蛋白的分泌,进行补充方案 phoA 融合蛋白的亚细胞定位,通过分级分离分析蛋白在细胞中的分布。

大量表达靶蛋白

12. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 25 ml 含氨苄(50ug/ml) 的 LB 培养液,在 125 ml 摇瓶中于 37°C 通气培养过夜。

13.5000 g(6500r/min Sorvall SS-34 转头)离心 15 min 收集细胞,沉淀重悬于 25 ml 诱导培养液,再次离心收集细胞。

14. 洗涤过的细胞重悬于 2.5 ml 诱导培养液,接种于 500 ml 诱导培养液,以预试验确定的最佳时间和最佳温度于 2L 摇瓶中培养。

15. 诱导适当时间后,于 4°C 以 4000 g(5000r/min Sorvall GSA 转头)离心 15 min 收集细胞。
如果使用带信号肽序列的 phoA 表达载体, 而且补充方案结果表明外源蛋白位于周质中. 用补充方案中介绍的渗透休克的方法纯化表达产物;如果所用载体不带信号肽序列用传统的层析方法纯化外源蛋白。




文章底部广告位

文章评论

加载中~