通过甘油分级梯度离心纯化λ噬菌体颗粒实验

本方案适用于制备噬菌体原种、制备噬菌体颗粒（用来获得 DNA 进行亚克隆）以及制备 λ 噬菌体臂。

λ 噬菌体颗粒悬浮液
EDTA 甘油 SM 胰 DNase Ⅰ
Beckman SW41 或 SW28 转子或相当型号 离心管

一、材料

1. 缓冲液和溶液

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0 )

甘油（5% 和 40%，V/V ) 于 SM 中

SM

2. 酶和缓冲液

胰 DNase Ⅰ (1 mg/ml)

胰 RNase 于 TE 中（1 mg/ml，pH 7.6)

3. 离心机和转子

Beckman SW41 或 SW28 转子或相当型号，配有清亮的离心管（如 Beckman 超亮离心管）

4. 载体和菌株

λ 噬菌体颗粒悬浮液

二、方法

1. 在 Beckman SW41 聚碳酸酯离心管（或相应离心管）中制备甘油分级梯度（每管加 5 ml 噬菌体悬浮液）：

(1) 取 3 ml 含 40% 甘油的 SM，加入至离心管管底。

(2) 在 40% 甘油溶液上小心加入 4 ml 含 5% 甘油的 SM。

(3) 在 5% 甘油的顶层小心加入噬菌体悬浮液，最后用 SM 补满。

2. 分级梯度于 4℃ 151000 g ( 35000 r/min 于 Beckman SW41 或 SW28 转子中）离心 60 min。

3. 去上清，每升培养物原液加 1 ml SM 重悬噬菌体沉淀。

4. 加胰 DNaseⅠ和 RNase 至终浓度分别为 5 μg/ml 和 1 μg/ml，37℃ 温育 30 min。

5. 加 0.5 mol/L 的 EDTA 储液（pH 8.0) 至终浓度为 20 mmol/L。