变性凝胶电泳实验基本方案

 

5.  按厂商指南用0.2~0.4 mm 均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶模夹层，注意垫片与平板的边、底压紧对齐。

6.  制作每块凝胶时，在100 ml 烧杯配制60 ml 所需的变性丙烯酰胺凝胶溶液，在灌胶（步骤7）前，彻底混匀60 μl TEMED和0.6 ml 10%过硫酸铵于每份丙烯酰胺溶液中。

 

7.  立即灌胶，用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液，避免吸入气泡，让短平板朝上， 并使凝胶平板夹层与臬面成45度角，沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间，其间可调整角度让胶液慢馒流入夹层的一边。

8.  当溶液达到短平板的顶部时，放下胶模夹层至其顶部边缘离操作台平面仍有5 cm 左右，其下垫一空的吸头盒或其他物件以使之保持较低的角度。

9.  将0.2~0.4 mm 厚的鲨鱼齿样品梳的平齐一侧插入胶液中，至短平板下约2~3 mm，操作须十分小心以避免产生气泡，用一个书本装订夹将平极之间的样品梳夹紧，以避免在掩子与平板间形 成凝胶固块。

10.  加一层过量的丙烯酰胺溶液至梳子，保证其被完全覆盖。用水冲洗注射器，除去过量的丙烯酰胺。

11.  除去每片胶模夹层的底部垫片或胶带，用刀片除去样品瓶周围的过量聚丙烯酰胺凝胶。

12.  用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，从每片胶模夹层中拨去鲨鱼齿样品梳，避免拉伤凝胶顶部。

13.  用水清洗梳子，准备好在步骤16操作时重新插回样品孔。如果用常规样品梳，小心防止撕裂聚丙烯酰胺加样孔，

 

14.  凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在2~3 cm 的一层缓冲液中，放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。

15.  上层贮槽倒入1×TBE缓冲液，使超过凝胶顶部约3 cm，用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE清洗凝胶顶部。

 

16.  将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新播回凝胶夹层，使其齿部仅可触及凝胶，用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。

 

17.  加样前，在45 V/cm 凝胶的电压降下预电泳，使凝胶预热，即在1 700 V，70 W 恒功率下电泳约30 min。

18.  在加样前，清洗加样孔除去浸进孔中的尿素。

 

19.  在甲酰胺/染料溶液中的样品，盖好盖子，在95℃加热2 min，然后置于冰上，每孔加 样2~3 μl 测序用的加样吸头可于每次加样后在下槽缓冲液中冲洗2次后继续使用。

20.  在45~70 W 恒功率下电泳，凝胶温度保持在约65℃。

21.  高于此温度可能会造成玻璃平板炸裂或条带弥散，而太低温度可使测序产物不完全变性、现察标志染料的迁移以确定电泳时间。

22.  将干冰加入干胶机的冷阱并预热至80℃。

23.  电泳完毕时，排出上下液槽的缓冲液，并按放射性废物处理丢弃液体。

24.  从电泳装置中取出凝胶夹层，并在冷自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止，将夹层平放在纸巾上，四口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液体及夹子、胶带，取出一边的垫片。

25.  两片玻璃平板之间插入一个长金属铲子，轻轻转动铲于将玻璃 平板橇起使之分开，凝胶应贴在下面的玻璃平板，如果贴在上面的平板，则将它翻转过来。

26.  从插有铲子的一边馒慢提起上面的平板，遂渐增加角度直至上层平板完全与凝胶分离。