寡核苷酸指导的单链 DNA 诱变实验
材料与仪器适用于转化的大肠杆菌菌株 用于转化的大肠杆菌 TG1 感受态菌ATP PE1缓冲液 PE2 缓冲液 噬菌体 T4 DNA 连接酶 噬菌体 T4 多核苷
材料与仪器
适用于转化的大肠杆菌菌株 用于转化的大肠杆菌 TG1 感受态菌
ATP PE1缓冲液 PE2 缓冲液 噬菌体 T4 DNA 连接酶 噬菌体 T4 多核苷酸激酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段 M13 噬菌体通用测序引物 含 4 种 dNTP 的 dNTP 溶液 诱变的 M13 噬菌体 单链 DNA 模扳 诱变的寡核苷酸引物 培养液 2XYT 顶层琼脂平板和 YT 琼脂平板
Falcon2059 试管（预冷）或电击杯 47°C 加热块或水浴 16°C、42°C 和 68°C 水浴 适合变性温度的水浴
ATP PE1缓冲液 PE2 缓冲液 噬菌体 T4 DNA 连接酶 噬菌体 T4 多核苷酸激酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段 M13 噬菌体通用测序引物 含 4 种 dNTP 的 dNTP 溶液 诱变的 M13 噬菌体 单链 DNA 模扳 诱变的寡核苷酸引物 培养液 2XYT 顶层琼脂平板和 YT 琼脂平板
Falcon2059 试管（预冷）或电击杯 47°C 加热块或水浴 16°C、42°C 和 68°C 水浴 适合变性温度的水浴
步骤
材料
缓冲液和溶液
各种贮存液，缓冲液和试剂成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释至所需的浓度。
ATP(10 mmol/L)
10xPE1缓冲液
200 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L MgCl2
500 mmol/L NaCl
10 mmol/L DTT
10XPE2 缓冲液
200 mmnl/L Tris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L MgCl2
100 mmol/L DTT
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 连接酶
噬菌体 T4 多核苷酸激酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段
延伸反应可使用任意一种 DNA 聚合酶（步骤 4 和 5)。Klenow 片段缺乏 5'端外切核酸酶活性，因此不能降解模板。然而, 其他酶例如噬菌体 T4DNA 聚合酶 (Nossal 1974,Geisselsoder et al.1987); 天然的 T7DNA 聚合酶（Bebenek and Kunkel 1989) 以及测序酶 Schena 1989,Venkitaiaman l989) 薄要较短的孵育时间。当磷酸化的诱变寡核苷酸被用做聚合反应或延伸反应单一引物时必须使用这些酶。不像 Klenow 片段，无论测序酶或天然的由噬菌体 T4 和 T7 编码的 DNA 聚合酶都不能从模板上置换诱变寡核苷酸（Nossal 1974，Kunkel 1985，Bebenek and Kunkel 1989，Schena 1989)。
核酸和寡核苷酸
M13 噬菌体通用测序引物
任何商业化的以 M13 单链噬菌体正链为模板用于引导 DNA 双脱氧测序反应的通用引物均适用于本方法。
含 4 种 dNTP 的 dNTP 溶液，每一种 dNTP 的浓度为 2 mmol/L。
使用高质量的 dNTP 以降低污染的 dUTP 掺入到 DNA 新合成链中的几率。我们认为 Pharmacia 公司生产的浓缩 dNTP 溶液效果良好。
诱变的 M13 噬菌体单链 DNA 模扳
诱变的寡核苷酸引物
应按照信息栏关于诱变寡核苷酸专题的所述设计诱变寡核苷酸。在定点诱变前用 Sep-Pak C18 柱屋析纯化诱变寡梭苷酸去除盐和其他杂质（请见第 10 章方案 6)。除非寒核苷酸长度超过 30 个梭苷酸或将被用于环入或去环诱变，否则不需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸。
培养液
2XYT 顶层琼脂平板和 YT 琼脂平板
专用设备
Falcon2059 试管（预冷）或电击杯
47°C 加热块或水浴
16°C、42°C 和 68°C 水浴
适合变性温度的水浴，
请见步骤 3, 热循环仪亦可用于上述步骤中。
其他试剂
步骤 1 所需要的试剂列在本章方案 1 中。
步骤 7 所需要的试剂列在第 12 章方案 3 和 4 中。
步骤 7 所需要的试剂列在本章方案 7 中。
载体和菌株
请见附录 3
适用于转化的大肠杆菌菌株（例如，TG1)
用于转化的大肠杆菌 TG1 感受态菌。
感受态细胞制备见第 1 章方某 25 和 26。
大肠杆菌菌株 TG1 过夜培养物
方法
1. 按方案 1 所描述的方法制备 M13 噬菌体单链模板。用离心柱层析纯化含尿嘧啶的模板。
2. 用噬菌体 T4 多核苷酸激酶对诱变体寡核苷酸和通用测序引物进行磷酸化，在不同的微量离心管中混合下列物质：
合成的寡核苷酸 100~200pmoles
10X 噬菌体 T4 多核苷酸激酶缓冲液 2ul
10 mmol/LATP 1ul
噬菌体 T4 多核苷酸激酶 4 单位
加水至 20ul
37°C 孵育反应 1 h, 然后 68°C 加热 10 min 灭活多核苷酸激酶。
3. 将磷酸化的诱变寡核苷酸和通用测序引物与含靶序列的单链 M13 噬菌体 DNA 复性。混合下列反应物：
单链模板 DNA(-1ug) 0.5pmole
磷酸化的诱变寡核苷酸 10pmoles
磷酸化的通用引物 10pmoles
10XPF11 缓冲液 1ul
加水至 10ul
在高于诱变寡核苷酸完全杂交的理论 Tm 值 20°C 以上的温度加热上述混合物 5 min, 计算 Tm 值的公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T),(G+C) 是寡核音酸中 G 和 C 残基的总和，（A+T) 是寡核苷酸中 A 和 T 残基的总和。将含有反应混合物的离心管转移至一个装有水的而且水温高于 Tm 值 20°C 以上的烧杯中。将烧杯放置在工作台上，待其缓慢冷却至室温（~20 min)。在微型离心机上稍微离心（5s) 收集所有的管壁上的冷凝液。
或者，加热或冷却核酸和寡核苷酸的操作可在热循环仪中进行。引物对模板的摩尔浓度比应为 10:1 或 50:1 使用过多的引物将增加靶 DNA 的异位突变频率。
4. 当退火反应冷却到室温时，将下列试剂混合在一新的 0.5 ml 的微量离心管中。
10 X PE2 缓冲液 1.0ul
2 mmol/L dNTP 溶液 1.0ul
10 mmol/L ATP 1.0ul
噬菌体 T4DNA 连接酶 5Weiss 单位
Klenow 片段 2.5 单位
将上述混合物置于冰上备用。
当使用噬菌体 T4DNA 聚合酶或测序酶时，在 0°C 孵育聚合/延伸反应（步骤 5)5 min，室温孵 5 min, 然后在 37°C 孵育 2 h。低温孵育有利于合成从 3'端 DNA 起始，后来在 37°C 孵育可提高延伸反应的效率。另外，应将反应中 4 种 dNTP 每一种的浓度增加至 500umol/L。这将显著增加延伸反应效率，并强烈抑制噬菌体 T4DNA 聚合酶的 3'端外切核酸酶活性。
5. 把 10ul 冰冷的步骤 4 反应混合物加入到含单链 DNA 和退火的寡核苷酸的混合物中 (步骤 3)。16°C 孵育该最终反应混合物 6~15 h。
6. 按以下步骤转染合适的感受态大肠杆菌宿主菌（例如 TG1)
a. 用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.6) 对反应混合物进行系列稀释（1:10,1:100,1:500)。
b. 准备一系列预冷的（0°C)Falcon2059 离心管，(i) 分別把 1ul、5ul 原始反应混合物和（ii)1ul、5ul 各种稀释度的反应混合物转移到离心管中。每个离心管中加入 200ul 感受态 TG1 细胞制备物。
c. 将上述混合溶液置于冰上 30 min, 再转移到 42°C 水浴中准确保温 2 min。
d. 从 42°C 水浴中取出反应物，加入 100ulTGl 过夜培养细胞。加入过量的细胞更易观察在菌苔中生长的 M13 噬菌斑。
如果步骤 b 中使用新制备的 TG1 细胞而不是冷冻的感受态细胞则不需要额外加入 TG1 细胞。
e. 每只离心管中加入 2.5 ml2xYT 顶层琼脂（融化并冷却至 47°C), 混合后铺在 YT 琼脂平板顶层。37°C 孵育平板 12~16 h 待噬菌斑形成。
也可以用电击法把突变的 DNA 导入大肠杆菌。电击法的转染频率通常比正常转染方法髙出许多，因此在电击前应将每份诱变反应混合物用水进行 1/100;1/500;1/1000 和 1/10000 倍系列稀释. 分别取 1~10ul 稀释液进行电击。
7. 通过对单链噬菌体 DNA 测序方法筛选噬菌斑（请见第 12 章方案 3 和 4)。如需要, 可通过放射性同位素标记的寡核苷酸探针筛选低频率出现的突变体。
缓冲液和溶液
各种贮存液，缓冲液和试剂成分请参阅附录 1。
将贮存液稀释至所需的浓度。
ATP(10 mmol/L)
10xPE1缓冲液
200 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L MgCl2
500 mmol/L NaCl
10 mmol/L DTT
10XPE2 缓冲液
200 mmnl/L Tris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L MgCl2
100 mmol/L DTT
酶和缓冲液
噬菌体 T4DNA 连接酶
噬菌体 T4 多核苷酸激酶
大肠杆菌 DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段
延伸反应可使用任意一种 DNA 聚合酶（步骤 4 和 5)。Klenow 片段缺乏 5'端外切核酸酶活性，因此不能降解模板。然而, 其他酶例如噬菌体 T4DNA 聚合酶 (Nossal 1974,Geisselsoder et al.1987); 天然的 T7DNA 聚合酶（Bebenek and Kunkel 1989) 以及测序酶 Schena 1989,Venkitaiaman l989) 薄要较短的孵育时间。当磷酸化的诱变寡核苷酸被用做聚合反应或延伸反应单一引物时必须使用这些酶。不像 Klenow 片段，无论测序酶或天然的由噬菌体 T4 和 T7 编码的 DNA 聚合酶都不能从模板上置换诱变寡核苷酸（Nossal 1974，Kunkel 1985，Bebenek and Kunkel 1989，Schena 1989)。
核酸和寡核苷酸
M13 噬菌体通用测序引物
任何商业化的以 M13 单链噬菌体正链为模板用于引导 DNA 双脱氧测序反应的通用引物均适用于本方法。
含 4 种 dNTP 的 dNTP 溶液，每一种 dNTP 的浓度为 2 mmol/L。
使用高质量的 dNTP 以降低污染的 dUTP 掺入到 DNA 新合成链中的几率。我们认为 Pharmacia 公司生产的浓缩 dNTP 溶液效果良好。
诱变的 M13 噬菌体单链 DNA 模扳
诱变的寡核苷酸引物
应按照信息栏关于诱变寡核苷酸专题的所述设计诱变寡核苷酸。在定点诱变前用 Sep-Pak C18 柱屋析纯化诱变寡梭苷酸去除盐和其他杂质（请见第 10 章方案 6)。除非寒核苷酸长度超过 30 个梭苷酸或将被用于环入或去环诱变，否则不需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸。
培养液
2XYT 顶层琼脂平板和 YT 琼脂平板
专用设备
Falcon2059 试管（预冷）或电击杯
47°C 加热块或水浴
16°C、42°C 和 68°C 水浴
适合变性温度的水浴，
请见步骤 3, 热循环仪亦可用于上述步骤中。
其他试剂
步骤 1 所需要的试剂列在本章方案 1 中。
步骤 7 所需要的试剂列在第 12 章方案 3 和 4 中。
步骤 7 所需要的试剂列在本章方案 7 中。
载体和菌株
请见附录 3
适用于转化的大肠杆菌菌株（例如，TG1)
用于转化的大肠杆菌 TG1 感受态菌。
感受态细胞制备见第 1 章方某 25 和 26。
大肠杆菌菌株 TG1 过夜培养物
方法
1. 按方案 1 所描述的方法制备 M13 噬菌体单链模板。用离心柱层析纯化含尿嘧啶的模板。
2. 用噬菌体 T4 多核苷酸激酶对诱变体寡核苷酸和通用测序引物进行磷酸化，在不同的微量离心管中混合下列物质：
合成的寡核苷酸 100~200pmoles
10X 噬菌体 T4 多核苷酸激酶缓冲液 2ul
10 mmol/LATP 1ul
噬菌体 T4 多核苷酸激酶 4 单位
加水至 20ul
37°C 孵育反应 1 h, 然后 68°C 加热 10 min 灭活多核苷酸激酶。
3. 将磷酸化的诱变寡核苷酸和通用测序引物与含靶序列的单链 M13 噬菌体 DNA 复性。混合下列反应物：
单链模板 DNA(-1ug) 0.5pmole
磷酸化的诱变寡核苷酸 10pmoles
磷酸化的通用引物 10pmoles
10XPF11 缓冲液 1ul
加水至 10ul
在高于诱变寡核苷酸完全杂交的理论 Tm 值 20°C 以上的温度加热上述混合物 5 min, 计算 Tm 值的公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T),(G+C) 是寡核音酸中 G 和 C 残基的总和，（A+T) 是寡核苷酸中 A 和 T 残基的总和。将含有反应混合物的离心管转移至一个装有水的而且水温高于 Tm 值 20°C 以上的烧杯中。将烧杯放置在工作台上，待其缓慢冷却至室温（~20 min)。在微型离心机上稍微离心（5s) 收集所有的管壁上的冷凝液。
或者，加热或冷却核酸和寡核苷酸的操作可在热循环仪中进行。引物对模板的摩尔浓度比应为 10:1 或 50:1 使用过多的引物将增加靶 DNA 的异位突变频率。
4. 当退火反应冷却到室温时，将下列试剂混合在一新的 0.5 ml 的微量离心管中。
10 X PE2 缓冲液 1.0ul
2 mmol/L dNTP 溶液 1.0ul
10 mmol/L ATP 1.0ul
噬菌体 T4DNA 连接酶 5Weiss 单位
Klenow 片段 2.5 单位
将上述混合物置于冰上备用。
当使用噬菌体 T4DNA 聚合酶或测序酶时，在 0°C 孵育聚合/延伸反应（步骤 5)5 min，室温孵 5 min, 然后在 37°C 孵育 2 h。低温孵育有利于合成从 3'端 DNA 起始，后来在 37°C 孵育可提高延伸反应的效率。另外，应将反应中 4 种 dNTP 每一种的浓度增加至 500umol/L。这将显著增加延伸反应效率，并强烈抑制噬菌体 T4DNA 聚合酶的 3'端外切核酸酶活性。
5. 把 10ul 冰冷的步骤 4 反应混合物加入到含单链 DNA 和退火的寡核苷酸的混合物中 (步骤 3)。16°C 孵育该最终反应混合物 6~15 h。
6. 按以下步骤转染合适的感受态大肠杆菌宿主菌（例如 TG1)
a. 用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.6) 对反应混合物进行系列稀释（1:10,1:100,1:500)。
b. 准备一系列预冷的（0°C)Falcon2059 离心管，(i) 分別把 1ul、5ul 原始反应混合物和（ii)1ul、5ul 各种稀释度的反应混合物转移到离心管中。每个离心管中加入 200ul 感受态 TG1 细胞制备物。
c. 将上述混合溶液置于冰上 30 min, 再转移到 42°C 水浴中准确保温 2 min。
d. 从 42°C 水浴中取出反应物，加入 100ulTGl 过夜培养细胞。加入过量的细胞更易观察在菌苔中生长的 M13 噬菌斑。
如果步骤 b 中使用新制备的 TG1 细胞而不是冷冻的感受态细胞则不需要额外加入 TG1 细胞。
e. 每只离心管中加入 2.5 ml2xYT 顶层琼脂（融化并冷却至 47°C), 混合后铺在 YT 琼脂平板顶层。37°C 孵育平板 12~16 h 待噬菌斑形成。
也可以用电击法把突变的 DNA 导入大肠杆菌。电击法的转染频率通常比正常转染方法髙出许多，因此在电击前应将每份诱变反应混合物用水进行 1/100;1/500;1/1000 和 1/10000 倍系列稀释. 分别取 1~10ul 稀释液进行电击。
7. 通过对单链噬菌体 DNA 测序方法筛选噬菌斑（请见第 12 章方案 3 和 4)。如需要, 可通过放射性同位素标记的寡核苷酸探针筛选低频率出现的突变体。
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