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DNA实验

哺乳动物细胞的选择标记

2024-06-08 DNA实验 加入收藏
材料与仪器哺乳动物步骤一、腺苷脱氨酶(ADA) 1. 选择条件:培养液中加10 μg/ml 胸腺嘧啶脱氧核苷,15 μg/ml 次黄嘌呤,4 μmol/l 腺



材料与仪器

哺乳动物

步骤

一、腺苷脱氨酶(ADA)
 
1.  选择条件:培养液中加10 μg/ml 胸腺嘧啶脱氧核苷,15 μg/ml 次黄嘌呤,4 μmol/l 腺嘌呤-9-β-D-呋喃木糖苷(Xyl-A),及0.01~0.3 μmol/l 2‘-脱氧助间型霉索(dCF)。胎牛血清中含有ADA可解除培养液的毒性,所以在用前才加入培养液中。

2.  选择原理:Xyl-A可转化成Xyl-ATP并掺入核酸中,从而导致细胞死亡。Xyl-A被ADA解毒成为其肌苷衍生物,dCF是ADA过渡态类似物,因而可以灭活母代细胞内源性的ADA,内源性ADA的水平因细胞不同而异,因此dCF的合适选择浓度也随之变化。
 
3.  说明:对于内源性ADA平高的细胞,转染的ADA基因必须高表达才行。现已有ADA缺陷的CHO细胞可供应用。通过提高dCF的水平,ADA可用于扩增系统
 
二、氨基糖苷磷酸转移酶(neo,G418,APH)
 
1.  选择条件:含100~800 μg/ml G418的完全培养液。G418应配制于高缓冲能力的溶液中,以使加入该药物后不至干改变培养液的pH值。
 
2.  选择原理:G418通过干扰核糖体的功能而阻断哺乳动物细胞的蛋白合成,它是一种氨基糖苷,在结构上与新霉素,庆大霉素及卡那霉素相似。因此在哺乳动物细胞中表达细菌的APH基因《来源于105〉可解除G418的毒性。
 
3.  说明:应试验不同浓度的G418,因为各种细抱被G418杀死的敏感性不同。许多研究者购买大量同一枇号的G413,因为不同批号药物之间的药效可能不同。在致死剂量的G418存在下,细胞还能分裂1~2次,因此该药的效果需要几天才能变得明显。
 
三、二氢叶酸还原酶(DHFR)
 
1.  选择条件:α-培养液中加0.01~300 μmol/l 氨甲蝶呤(MTX)及透析过的胎牛血清。
 
2.  选择原理:DHFR对于嘌呤的生物合成是必不可少的。因此,在无外源性嘌吟存在时它对细胞生长是必需的。透析血清以除去内源性的核苷,并采用无核苷的培养液,这些对于选择都是必要的。MTX是DHFR的竞争性抑制剂,因此增加的MTX浓度可以选择DHFR的高表达。
 
3.  说明:对于内源性DHFR水平高的细胞,需要极高水平地表达被转染的正常DHFR基因才能进行选择。已有一种突变的尺基因,其编码的酶对MTX有抗性,因而在大多数细胞中能用来做显性选择,采用DHFR缺陷的细胞时,DHFR可用来扩增被转染的基因。
 
四、潮霉衆B磷醱转移酶(HPH)
 
1.  选择条件:含有10~400 μg/ml 潮霉素B的完全培养液。
 
2.  选箨原理:潮霉素B是一种氨基环多醇,通过破坏转位及促进错译而抑制蛋白质的合成。HPH基因通过磷酸化作用而解除潮霉素B的毒性。
 
3.  说明:HPH基因只是近几年来才用于哺乳动物细胞系统。并且,能有效表达该基因的载体尚未广泛流传,虽然用于选择的潮霉素B浓度可在10~400 μg/ml 之间变化,但许多细胞需用的浓度为200 μg/ml。
 
五、胸苷激酶(TK)
 
1.  选择条件:正向选择,完全培养液中加100 mmol/l 次黄嘌呤0.4 μmol/l氨基喋呤,16 μmol/l 胸苷及3 μmol/l 甘氨酸。反向选择,完全培养液中加30 μg/ml 5-溴脱氧尿苷(BUdr)。
 
2.  选择原理:在正常生长条件下,细胞并不需要胸苷激酶,因为合成dTTP的通常途径是通过dCDP。在培养液中加BUdr将杀死TK+细胞,因为BUdr被TK磷酸化之后可掺入DNA中。用HAT培养液选择TK+细胞主要是由于氨基蝶呤的存在能阻断dCDP变成3dTDP。这样,细胞就需要胸苷激酶从胸苷来合成dTTP。
 
3.  说明:因为有正向及反向选择条件,胸苷激酶得到了广泛的应用,与ADA及DHFR不同的是,无法对不同的TK表达水平的细胞进行选择,因此该基因不能用于基因扩增。与ADA及DHFR相同的是,许多哺乳动物细胞都能表达TK,使得在这些细胞中不能用该标记基因,除非用BUdr选择出TK突变株。
 
六、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核耱转移酶(XGPRT,gpt)
 
1.  选择条件:培养液中含有透析过的胎牛血请,250 μg/ml 黄嘌呤,15 μg/ml 次黄嘌吟,10 μg/ml胸苷,2 μg/ml氨基蝶呤,25 μg/ml霉酚酸及150 μg/ml L-谷氨酰胺。

2.  选择原理:氨基蝶呤及霉酚酸都可以阻断GMP合成的全途径。XGPRT的表达使细胞能从黄嘌呤合成GMP,因而细胞能在含有黄嘌呤但不含鸟嘌呤的培养液中生长。因此有必要用透析过的胎牛血清及无鸟嘌呤的培养液。
 
3.  说明:XGPRT是在哺乳动物中无同源物的细菌来源的酶,因而可在哺乳动物细胞中用作显性选择标记。用于选择的霉酚酸的用量因细胞而异,能通过有鸟嘌呤存在或无其存在时进行滴定而测定。


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