cRNA探针在原位杂交组织化学

cRNA探针在原位杂交组织化学（ISHH）中的应用

　　Angerer及其同事们首先应用RNA探针于原位杂交（见Cox et al 1984），核酸探针为单链的RNA分子，产生自具有质粒逆转录系统的cDNA克隆。由于它是单链的，不像双链的DNA探针，在溶液中不会再退火（reanneal），因此，较大百分比的探针可参与杂交反应，较cDNA探针的信号强。

除此之外，在溶液中产生的cRNA-mRNA杂交体比相应的cDNA-mRNA杂交体稳定，但在原位杂交中是否如此尚未证明。cRNA探针不足之处在于有时比DNA探针粘性强（stickier）。可与组织产生较高的非特异性结合，但此缺陷可在杂交后漂洗液中加用酶漂洗来解决。

最近，Wolf等（1987）建议插入确定长度的寡核苷酸至 载体 内产生cRNA分子，这种cRBA分子称为“寡核苷酸核酸探针”（oligoribo－probes）已被成功的用于原位杂交实验。

一、同位素标记cRNA探针在ISHH中的应用

（一）组织切片的原位杂交细胞化学方法

（1）组织准备：大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g 体重），或1%戊巴比妥钠约1ml（3～4mg/100g体重）腹腔内注射麻醉，用100ml生理盐水冲洗和150ml 4%多聚甲醛主动脉灌注固定。固定半小时后，取出组织块，置入4%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。

如要取脑组织，可于灌注后置4℃冰箱内过夜，次晨取脑组织，后固定4℃4h左右。

（2）组织切片/培养细胞在经过处理，抹以粘附剂的载片上，在43℃烤箱过夜。

（3）在PBS（0.1mol/l Ph7.2）中浸5～10min。

（4）浸于0.1mol/L甘氨酸―PBs 液内5min。

（5）为增强组织通透性，将载片置于0.3%Triton X-100(在PBS内)10～15min。

（6）PBS洗3×5min。

（7）在蛋白激酶K（1μg/ml）溶于Tris HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA（50mmol/L,pH8）中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。

（8）浸入新鲜配制的4%多聚甲醛（在PBS0.1mokl/L,pH7.2）3min以终止消化作用和再固定。

（9）浸入新鲜配制的含0.25%（V/V）三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0）中，10min以达乙酰化（acetylate）的目的。

（10）预杂交：在50%（V/V）甲酰胺溶于4×SSC预热37℃15～45min 。

　　（11）杂交：将载片上过量的甲酰胺液倾去，加20μl杂交混合液（含放射性同位素标记的探针量为5×10 3～ 10 6 cpm/每张载片）。覆以硅化的盖玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒内以保持湿度，42℃孵育12～18h。为使载片不致于浸泡于SSC溶液内，通常以二根玻管（或棒）扎成担架状，载片置于玻棒上，与盐液不接触，但可保持盒内空气湿润。

（12）杂交后漂洗

①以小烧杯盛适量4×SSC溶液，将载片一端斜插入溶液内，轻轻抖动以移除盖玻片。

②将载片置于有刻度的染色用小方玻缸内，加入42℃（预热）4×SSC，3×20min。在漂洗过程中宜不断振动，以增强漂洗效果。如设有调整钮的振动台更为理想。

③加20μlRNA酶溶液（20μg/ml）在NaCl(0.5mol/L)、Tris HCl (pH8.0)和EDTA（1mmol/L,pH8.0）消化未杂交探针，42℃30min（也有不加EDTA的）。

④以递减梯度盐溶液SSC漂洗载片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。

⑤梯度酒精脱水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室温，每次10min，空气干燥后待进行放射自显影。

（13）放射自显影和复染

①在暗室中预热水浴至45℃，将分装的核乳胶溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同时预热一电热板至45℃。将杂交后漂洗过完全干燥的载片依次排列于玻片架上，有组织切片一面面向实验者。在实验的载玻片前放1～2张无切片的干净玻片，作为测定核乳胶溶解度与浸片高度等的空白对照片。

浸泡（Dipping）过核乳胶膜的载片放入暗盒内，事先最好将暗盒准备好，为保持干燥，放入一包变色硅胶干燥剂（无水干燥剂为小块蓝色晶体，吸水后呈粉红色，置烤箱中烘干待转成蓝色后可重复应用），预先备好封固暗盒用的胶带备用。

②核乳胶液，国外产品为ILFord K5乳胶液，国内核乳胶产品可自原子能研究所订购。不论国产或进口乳胶，事先应（按说明需要浓度）稀释分装在10ml小瓶内，密封于暗盒内，4℃备用。反复的冷冻和融解核乳胶会增加背景染色。每一小瓶供一次性实验应用。

为节　省核乳胶，切片宜贴附在靠近载片的一端。这样，在浸泡时少量乳胶便可充分覆盖切片。

③浸核乳胶（Dipping）：当一切准备工作就绪后，在暗室中（只留完全灯）先将载片置于电热板上预热1～2min。以空白载片浸入核乳胶液，取出后检查核乳胶是否充分溶解，玻片上有无气泡。然后正式进行切片浸入。浸核乳胶膜是一项需反复操练的技术。

以拇、食指夹住玻片一端，以垂直方向进入乳胶，进入的提出均应采取中速度，且速度应保持稳定，提出后可将玻片一端滴下的乳胶轻沾于吸水纸上，掌握好该技术，浸入形成的核乳胶膜厚度适当，均匀一致。依序放在预热45℃的电热板，倾斜度应一致。在45℃电热板上干燥至少1～2h，在此期间应严格控制在黑暗中。

　　④装入暗盒曝光：将载片架上已干燥覆有核乳胶的载片放入暗盒内，周围用胶带封固，以标签写明：样品种类，实验者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱内。

曝光时间依同位素种类而异， 32 P大约需5～7日， 3 H需4周，但还要参考细胞内mRNA的含量而定，含量高者曝光时间宜短，反之宜适当延长。可根据不同曝光时间的实验结果予以调整。曝光时间长可增加信号，但也增加背景，反之，信号减弱，但背景亦低。

⑤显影：取出切片中暗盒（注意：切勿启封），放在室温至少1h，使其回升到室温。然后在暗室内（只留安全灯），将载片置入Kodax D19显影液（预调温至18～20℃）3min。水冲片刻后入Kodax F24固定剂内3min。

上述溶液及水温最好都保持在18～20℃。突然改变溶液温度会损坏精细的核乳胶膜。另外，在显影和定影过程中不要振荡溶液，因为，这时的乳胶还是处于胶状结构，溶液振荡的冲击可使乳胶膜产生划痕。

⑥冲洗，脱水和复染：用自来水（水冲力勿过猛）冲洗载片20min，如需要可用1%苏木精复染，复染后自来水冲洗分化2min，梯度酒精脱水（70%，90%，100%）每次3min，二甲苯透明，DPX封片。

（二）培养细胞的原位杂交细胞化学方法

　　（1）固定：通常将 细胞培养 在盖玻片或塑料薄膜上，可将盖玻片取出，倾去培养液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依组织切片处理法进行ISHH实验。也有在4%多聚甲醛室温固定20min后，由低浓度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鲜配制的70%酒精中，4℃，备用。

　　（2）重回到水：50%，30%酒精3min，无菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/l MgCl 2 10min，室温（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl 2 ）。

（3）0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室温10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，应用重蒸水制成200ml）。

以后步骤同（一）组织切片法。

二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用

（一）光敏生物素标记cRNA探针的应用

以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针，使其最终浓度为0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦卤素灯下，距离光源20cm处照射30min。

用仲丁醇抽提游离生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针，将其溶于适量的灭菌双蒸水，用紫外分光光度计测探针的光密度（详第十九章　），其最佳工作浓度为2μg/ml。

切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节　。