放射自显影和从测序凝胶上读取 DNA 序列实验
材料与仪器步骤材料缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂的配方见附录 1。将贮存液稀释到合适的浓度。凝胶固定液300 ml 甲醇2.4L 水300 ml 冰醋酸放射性
材料与仪器
步骤
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的配方见附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。
凝胶固定液
300 ml 甲醇
2.4L 水
300 ml 冰醋酸
放射性混合物
放射性墨水或化学发光标记物
参见附录 9。
可重复使用的放射性墨水主要是选择 Stratagene 的冷光标记物（Glosos)。标记物能被多次运用而且应该恰拾在一个新的放射自显影循环之前被暴露在荧光灯下。
凝胶
DNA 测序胶
准备和电泳见方案 8~11。
特殊设备
放射自显影暗盒（金属，弹簧 35.6 cmX43.2 cm)
放射增感屏
每个胶片需要两个大的增强的钨酸钙屏幕（例如，LighteningPlus,Dupont)。
80°C 的凝胶干燥机
凝胶干燥机应该被连接在一个真空系统上。
聚脂薄膜片（在长和宽上比凝胶大约 5 cm)
聚脂薄膜是为了保证凝胶在真空条件下干燥时保持平整。
丝龙（Saran) 巾
不锈钢的金属小铲或手术刀
固定凝胶的托盘
托盘应该在长和宽上比凝胶大约 5 cm
Whatman3 MM CHR 滤纸（或等同的）
Whatman3 MM 滤纸（或等同的）
X 射线胶片（蓝光敏感型 35 cmX43 cm）
对 32P 标记的 DNA 用双层胶片如 X-Omat-AR(Kodak) 或 BioMaxMS(Kodak)。对 32P 和 35S 标记的DNA 用单层胶片如 BioMaxMR(Kodak)。
X 射线胶片处理器
方法
1. 在电泳结束后，关闭电源并使测序装置和电源之间不再连接。弃去电源缓冲液，从装置上取下胶模。
2. 将胶模平放在带有塑料的保护性实验室布上，使较小的（带槽的）板位于最上方。
在操作前使凝胶冷却到 37°C 以下。
3. 除去所有剩余的凝胶密封带，用刮勺的一头去慢慢地轻轻地撬开胶模的玻璃板。凝胶应该贴在较长的 (无槽的) 玻璃板上。
警告：要带好安全眼镜, 因为在这个步骤中玻璃板有时会破碎。同时，玻璃板的表面和凝胶接触后可能会粘有放射性物质，应该妥善对待。
如果测序反应的产物是用 32P 标记的话步骤 4~13 可以省略。例如，酶法测序是用由 32P 标记的引物引发的或 [a-32P]dNTP 在一个未标记的引物延伸时合并进去。当用袖珍监测器去扫描凝胶表面时，20~100cps 的阅读量表示有足够的放射性材料用于染色。在这种情况下，用 Saran 包装膜盖上凝胶，确保其上没有褶皱。标记方向，直接将凝胶向 X 射线胶片暴露。此过程可能会出现放射性液体的泄漏，所以需离凝胶远一些，不要为了节省几小时的工作而冒险。
Maxam-Gilbert 测序反应中标记产物的放射活性通常不足以进行固定和染色。
4. 当玻瑰板分开后，将凝胶上先加样一侧的底角或顶角切去，以便在后续操作中确定凝胶的方向。
5. 将凝胶固定到凝胶固定液中（甲醇/乙酸；见材料）
含有 33P 或 35S 的测序凝胶在干燥以前应该先固定。这步是供用 32P 中标记的凝胶选择的。固定提髙了分辨率。有时候加强了部分放射性信号的强度，并且减少了尿素或来自凝胶的甲酰胺的过髙浓度。固定也是移开凝胶的最后一个手段，因为凝胶很可能粘在胶模的两块板上。
6. 把凝胶（连同它的支持玻璃板一起）转移到含有甲醇：乙酸溶液的浅盘中。在室温下固定凝胶 30 min。固定期间不要搅动液体。
越薄的凝胶固定越快，越厚的凝胶越慢。一个 0.2 mm 厚的凝胶要固定 lOmin, 而 0.6 mm 厚的就需要 1b。
—批固定液能被用来固定几块凝胶。如果凝胶出现从支持玻璃板上脱落的征兆，可用硬塑料网（许多五金商店有售）盖住以防滑掉或皱成一团。
7.30 min 以后，从固定液中非常非常慢地抬起玻璃板。在玻璃板上的大部分固定液排出之前要尽量保持板水平。把玻璃板放在一打纸中上，有凝胶一侧在上。用 Kimwipes 纸擦去玻璃板上所剩的固定液。注意不要让 Kimwipes 纸与凝胶表面接触。
然后戴手套把凝胶上的褶皱和破损的地方轻柔地除去。
8. 准备一张 Whatman3 MMCHR 滤纸（或同等的），滤纸的长与宽均比凝胶略大一些(2~3 cm), 使滤纸保持弓形，把弓形滤纸的中心和凝胶的中心接触。让滤纸轻轻的落在凝胶的表面，然后轻轻压一下使凝胶与滤纸的粗糙面牢牢相貼。
9. 一手将滤纸扶住，另一手将支持玻璃板提起，迅速将其翻转，放在实验台上玻璃板向上。把玻璃板轻轻地向上提使 Whatman3 MMCHR 滤纸从玻璃板上分离下来。当玻璃板完全移开时，凝胶将与滤纸相貼。
10. 将 Whatman3 MMCHK 滤纸（凝胶朝上）放在两张 Whatman3 MM 滤纸上，剪一张略大且宽于凝胶的 Swan 包装膜放在凝胶之上。尽量避免折痕和气泡的出现。这一步如在另一个人的帮助下会更容易完成。拿住 Sarari 包装膜的角向外拉以使之绷紧伸展。将展平的 Saran 包装膜放置到凝胶上面。一旦 Saran 包装膜与凝胶接触，就不要再试图掀起它，因为这能使凝胶被撕裂。琼脂糖凝胶梳的扁平末端、Kimwipess 纸或一张塑料卡都能把凝胶和包装膜之间的气泡赶走。
之所以这么选择是因为放一张合适的 Saran 包装膜在实验台上能确保不出现褶皱，然后可将凝胶颠倒使凝胶面向下朝向 Saran 包装膜。
11. 用切纸刀或一把剪刀将所有 3 张 Whatman 滤纸和 Saran 包装膜修剪使之与凝胶大小相同。
12. 将由滤纸、凝胶和 Saran 包装膜组成的夹层放到凝胶干燥机中。包装膜在最上面，在干燥期间用一片聚脂薄膜来保持夹层的平整。
13. 根据干燥机生产商的说明，在真空下 80°C 干燥凝胶 30~60 min。
干燥凝胶缩短了放射性粒子命中 X 射线胶片的距离，因此增加了探测的敏感度。
14. 从干燥机中取出凝胶，剥去 Saran 包装膜。干燥过的凝胶应该摸上去很光滑而不黏。如果发黏，一个补救的方法就是把乳胶手套翻过来使有滑石粉的内侧向外，用手套内侧的滑石粉去拂凝胶表面。为了确定凝胶的方向，应在切去凝胶底角（步骤 4) 后 3 MMCHR 滤纸上形成的空缺处贴上一个用放射性的或化学荧光墨水做标记的黏性小标签。
15. 在暗室里，把干燥的凝胶放进一个弹簧金属箱里。用一片未曝光的 X 射线胶片覆盖，关上暗盒。在室温或-80°C 进行 16~24 h 的放射自显影。
一块测序胶所要求的最佳曝光时间难以精确预测。在测序反应期间如果每件亊都很好的进行的话，由于 5 或更多的因素。16~24 h 也许长了点。在不太好的情况下，通常要求曝光时间长一些。在这点上的主要目的是着着测序反应是否进行的很好和看带的强度决定建立一个或更多的颤外曝光。
16. 按照胶片生产商的要求将放射自显影片显影，按下面读取 DNA 序列所述。
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的配方见附录 1。
将贮存液稀释到合适的浓度。
凝胶固定液
300 ml 甲醇
2.4L 水
300 ml 冰醋酸
放射性混合物
放射性墨水或化学发光标记物
参见附录 9。
可重复使用的放射性墨水主要是选择 Stratagene 的冷光标记物（Glosos)。标记物能被多次运用而且应该恰拾在一个新的放射自显影循环之前被暴露在荧光灯下。
凝胶
DNA 测序胶
准备和电泳见方案 8~11。
特殊设备
放射自显影暗盒（金属，弹簧 35.6 cmX43.2 cm)
放射增感屏
每个胶片需要两个大的增强的钨酸钙屏幕（例如，LighteningPlus,Dupont)。
80°C 的凝胶干燥机
凝胶干燥机应该被连接在一个真空系统上。
聚脂薄膜片（在长和宽上比凝胶大约 5 cm)
聚脂薄膜是为了保证凝胶在真空条件下干燥时保持平整。
丝龙（Saran) 巾
不锈钢的金属小铲或手术刀
固定凝胶的托盘
托盘应该在长和宽上比凝胶大约 5 cm
Whatman3 MM CHR 滤纸（或等同的）
Whatman3 MM 滤纸（或等同的）
X 射线胶片（蓝光敏感型 35 cmX43 cm）
对 32P 标记的 DNA 用双层胶片如 X-Omat-AR(Kodak) 或 BioMaxMS(Kodak)。对 32P 和 35S 标记的DNA 用单层胶片如 BioMaxMR(Kodak)。
X 射线胶片处理器
方法
1. 在电泳结束后，关闭电源并使测序装置和电源之间不再连接。弃去电源缓冲液，从装置上取下胶模。
2. 将胶模平放在带有塑料的保护性实验室布上，使较小的（带槽的）板位于最上方。
在操作前使凝胶冷却到 37°C 以下。
3. 除去所有剩余的凝胶密封带，用刮勺的一头去慢慢地轻轻地撬开胶模的玻璃板。凝胶应该贴在较长的 (无槽的) 玻璃板上。
警告：要带好安全眼镜, 因为在这个步骤中玻璃板有时会破碎。同时，玻璃板的表面和凝胶接触后可能会粘有放射性物质，应该妥善对待。
如果测序反应的产物是用 32P 标记的话步骤 4~13 可以省略。例如，酶法测序是用由 32P 标记的引物引发的或 [a-32P]dNTP 在一个未标记的引物延伸时合并进去。当用袖珍监测器去扫描凝胶表面时，20~100cps 的阅读量表示有足够的放射性材料用于染色。在这种情况下，用 Saran 包装膜盖上凝胶，确保其上没有褶皱。标记方向，直接将凝胶向 X 射线胶片暴露。此过程可能会出现放射性液体的泄漏，所以需离凝胶远一些，不要为了节省几小时的工作而冒险。
Maxam-Gilbert 测序反应中标记产物的放射活性通常不足以进行固定和染色。
4. 当玻瑰板分开后，将凝胶上先加样一侧的底角或顶角切去，以便在后续操作中确定凝胶的方向。
5. 将凝胶固定到凝胶固定液中（甲醇/乙酸；见材料）
含有 33P 或 35S 的测序凝胶在干燥以前应该先固定。这步是供用 32P 中标记的凝胶选择的。固定提髙了分辨率。有时候加强了部分放射性信号的强度，并且减少了尿素或来自凝胶的甲酰胺的过髙浓度。固定也是移开凝胶的最后一个手段，因为凝胶很可能粘在胶模的两块板上。
6. 把凝胶（连同它的支持玻璃板一起）转移到含有甲醇：乙酸溶液的浅盘中。在室温下固定凝胶 30 min。固定期间不要搅动液体。
越薄的凝胶固定越快，越厚的凝胶越慢。一个 0.2 mm 厚的凝胶要固定 lOmin, 而 0.6 mm 厚的就需要 1b。
—批固定液能被用来固定几块凝胶。如果凝胶出现从支持玻璃板上脱落的征兆，可用硬塑料网（许多五金商店有售）盖住以防滑掉或皱成一团。
7.30 min 以后，从固定液中非常非常慢地抬起玻璃板。在玻璃板上的大部分固定液排出之前要尽量保持板水平。把玻璃板放在一打纸中上，有凝胶一侧在上。用 Kimwipes 纸擦去玻璃板上所剩的固定液。注意不要让 Kimwipes 纸与凝胶表面接触。
然后戴手套把凝胶上的褶皱和破损的地方轻柔地除去。
8. 准备一张 Whatman3 MMCHR 滤纸（或同等的），滤纸的长与宽均比凝胶略大一些(2~3 cm), 使滤纸保持弓形，把弓形滤纸的中心和凝胶的中心接触。让滤纸轻轻的落在凝胶的表面，然后轻轻压一下使凝胶与滤纸的粗糙面牢牢相貼。
9. 一手将滤纸扶住，另一手将支持玻璃板提起，迅速将其翻转，放在实验台上玻璃板向上。把玻璃板轻轻地向上提使 Whatman3 MMCHR 滤纸从玻璃板上分离下来。当玻璃板完全移开时，凝胶将与滤纸相貼。
10. 将 Whatman3 MMCHK 滤纸（凝胶朝上）放在两张 Whatman3 MM 滤纸上，剪一张略大且宽于凝胶的 Swan 包装膜放在凝胶之上。尽量避免折痕和气泡的出现。这一步如在另一个人的帮助下会更容易完成。拿住 Sarari 包装膜的角向外拉以使之绷紧伸展。将展平的 Saran 包装膜放置到凝胶上面。一旦 Saran 包装膜与凝胶接触，就不要再试图掀起它，因为这能使凝胶被撕裂。琼脂糖凝胶梳的扁平末端、Kimwipess 纸或一张塑料卡都能把凝胶和包装膜之间的气泡赶走。
之所以这么选择是因为放一张合适的 Saran 包装膜在实验台上能确保不出现褶皱，然后可将凝胶颠倒使凝胶面向下朝向 Saran 包装膜。
11. 用切纸刀或一把剪刀将所有 3 张 Whatman 滤纸和 Saran 包装膜修剪使之与凝胶大小相同。
12. 将由滤纸、凝胶和 Saran 包装膜组成的夹层放到凝胶干燥机中。包装膜在最上面，在干燥期间用一片聚脂薄膜来保持夹层的平整。
13. 根据干燥机生产商的说明，在真空下 80°C 干燥凝胶 30~60 min。
干燥凝胶缩短了放射性粒子命中 X 射线胶片的距离，因此增加了探测的敏感度。
14. 从干燥机中取出凝胶，剥去 Saran 包装膜。干燥过的凝胶应该摸上去很光滑而不黏。如果发黏，一个补救的方法就是把乳胶手套翻过来使有滑石粉的内侧向外，用手套内侧的滑石粉去拂凝胶表面。为了确定凝胶的方向，应在切去凝胶底角（步骤 4) 后 3 MMCHR 滤纸上形成的空缺处贴上一个用放射性的或化学荧光墨水做标记的黏性小标签。
15. 在暗室里，把干燥的凝胶放进一个弹簧金属箱里。用一片未曝光的 X 射线胶片覆盖，关上暗盒。在室温或-80°C 进行 16~24 h 的放射自显影。
一块测序胶所要求的最佳曝光时间难以精确预测。在测序反应期间如果每件亊都很好的进行的话，由于 5 或更多的因素。16~24 h 也许长了点。在不太好的情况下，通常要求曝光时间长一些。在这点上的主要目的是着着测序反应是否进行的很好和看带的强度决定建立一个或更多的颤外曝光。
16. 按照胶片生产商的要求将放射自显影片显影，按下面读取 DNA 序列所述。
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