定点诱变实验基本实验
材料与仪器DNATE 寡核苷酸引物 质粒 dNTP DNA聚合酶 氯仿 石蜡油 无水乙醇离心管 热循环仪 离心机步骤1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待
材料与仪器
DNA
TE 寡核苷酸引物 质粒 dNTP DNA聚合酶 氯仿 石蜡油 无水乙醇
离心管 热循环仪 离心机
TE 寡核苷酸引物 质粒 dNTP DNA聚合酶 氯仿 石蜡油 无水乙醇
离心管 热循环仪 离心机
步骤
1. 利用突变区两侧的限制性内切酶位点将待诱变的DNA片段亚克隆进高拷贝数的载体中。
2. 用小量制备的质粒提取模板DNA，用TE缓冲液重悬100 ng DNA至终浓为1 ng/μl。
3. 合成寡核苷酸引物，以变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化，重悬于500 μl TE缓冲液中，在A260吸光度，调整浓度至500 ng/μl。
4. 往两个500 μl 量离心管加入下列试剂，其中一管加寡核苷酸1，另一管加寡核苷酸2：
10 μl 10×扩增反应缓冲液
10 μl 2 mmol/l 4种dNTP
10 μl 2 mmol/l 4种dNTP
1 μl 寡核苷酸1或2
1 μl 适当的M13侧翼序列引物，正向或反向
加水至99.5 μl
0.5 μl Taq DNA聚合酶
用100 μl 石蜡油覆盖上述反应液
1 μl 适当的M13侧翼序列引物，正向或反向
加水至99.5 μl
0.5 μl Taq DNA聚合酶
用100 μl 石蜡油覆盖上述反应液
5. 按下列条件在自动热循环仪上扩增20~5个循环：
45 s 93℃（变性）
2 min 50℃（杂交）
2 min 70℃（延伸）
45 s 93℃（变性）
2 min 50℃（杂交）
2 min 70℃（延伸）
最后一个循环结束后，在72℃保温10min。
6. 取4 μl进行非变性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，以验证扩增反应已产生了预期的 产物。
7. 吸去石蜡油，并用氯仿抽提1次以去掉剩余的石蜡油，酚抽提和乙醇沉淀。
8. 取扩增所得的DNA片段的一半量用侧翼的和所引入的限制性内切酶切割，用低熔点琼脂糖电泳纯化、酶切片段。
9. 经连接反应将两条片段亚克隆进合适的已经相应的内切酶消化后的载体，以获得含引入限制性酶切点的DNA片段的重组质粒。
10. 将质粒转化入大肠杆菌，小置制备质粒DNA。
11. 通过DNA测序分析扩增的片段部分，以证实突变已经引入。
8. 取扩增所得的DNA片段的一半量用侧翼的和所引入的限制性内切酶切割，用低熔点琼脂糖电泳纯化、酶切片段。
9. 经连接反应将两条片段亚克隆进合适的已经相应的内切酶消化后的载体，以获得含引入限制性酶切点的DNA片段的重组质粒。
10. 将质粒转化入大肠杆菌，小置制备质粒DNA。
11. 通过DNA测序分析扩增的片段部分，以证实突变已经引入。
常见问题
