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DNA实验

生物素酰化探针的检测实验(比色法)

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
材料与仪器DNA磷酸酶缓冲液 封阻液 牛血清蛋白 TE NBT离心机 分光光度计 摇床步骤1. 用DNA稀释缓冲液,稀释生物素酰化标准DNA,浓度为0、1、2


材料与仪器

DNA
磷酸酶缓冲液 封阻液 牛血清蛋白 TE NBT
离心机 分光光度计 摇床

步骤

1.  用DNA稀释缓冲液,稀释生物素酰化标准DNA,浓度为0、1、2、5、10和20 pg/μl。以同样稀释液处理待测DNA。

2.  对干硝酸纤维素滤膜:每个稀释度取1 μl 点膜,在80℃供干约1 h接步骤4。
 
3.  对于足龙膜:每个稀释度取1 μl 点膜,晾干后用紫外照射法将DNA交联至膜上。接步骤4或化学发光检测。
 
4.  用少量体枳AP7.5液沆膜1 min,在密封袋中(剪成合适大小),用10 ml 封阻液,37℃封闭1 h 注意排出气泡。

5.  稀释10 μl 亲和素-AP交联物至10 ml AP7.5。剪去封闭袋一角挤出封闭液,用亲和素-AP交联物代替,重新封口,在旋转平台室温揺荡10 min。

6.  从袋中取出滤膜移到一个浅盘中,用200 ml AP7.5冼2次,每次15 min。再用 200 ml AP9. 5洗1次,10 min,轻微摇荡。

7.  加入33 μl 75mg/ml 的NBT至7.5 ml AP9.5液中,混匀。再加入25 μl 50 mg/ml BCIP,混匀。

8.  在浅盘中避光温育溶液,不时观察直至发色达到满意程度为止。
 
9.  加TE pH8.0以终止反应,比较测定DNA样品和标准DNA的颜色强度以确定生物素酰化dNTP的掺入效率。如果该探计至少有一半标准品的强度,它可作为探针用于原位杂交。


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