DNA 纯化实验（DNA凝胶回收试剂盒纯化法）

本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中提取多至 8 μg DNA（70 bp-10 Kb），回收率为 60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中溶解，其中的保护剂能防止线状 DNA 在高温下降解，然后在 DE-B 溶液的作用下使 DNA 选择性结合到膜上。纯化的 DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。

一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 

1.  说明书，耗材：DNA 制备管、2 ml 离心管、1.5 ml 离心管。
 

2.  Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含 DNA 保护剂，防止 DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。
 

3.  Buffer DE-B：结合液（促使大于 70 bp 的 DNA 片段选择性结合到 DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。若出现沉淀，应于 70℃温育溶解并冷却至室温后再使用。

4.  Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
 

5.  Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用

100%无水乙醇或 95%乙醇。
 

6.  Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
 

二、实验准备
 

1.  第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
 

2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
 

3.  准备75℃水浴。

三、操作步骤
 

1.  在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录 1.5 ml  离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg = 100 ul 体积）。
 

2.  加入 3 个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40℃加热），间断混合（每 2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min）。
 

3.  加 0.5 个 Buffer DE-A  体积的 Buffer DE-B，混合均匀；当分离的 DNA 片段小于 400 bp 时，加入 1个凝胶体积的异丙醇。
 

步骤 4-6 可以选择负压法或离心法。
 

A.  负压法
 

4A.  正确连接负压装置，将 DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤 3 中的混合液，转移到制备管中，开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。
 

5A.  加 0.5 ml Buffer W1，吸尽管中溶液。
 

6A.  加 0.7 ml Buffer W2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗涤一次。
 

~undefined  确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

B.  离心法
 

4B.  吸取 3 中的混合液，转移到 DNA 制备管（置于 2 ml  离心管）中，12 000xg 离心 1 min。弃滤液。
 

5B. 将制备管置回离心管，加 0.5 ml Buffer W1，12 000xg 离心 30 s，弃滤液。
 

6B.  将制备管置回离心管，加 0.7 ml Buffer W2，12 000xg 离心 30 s，弃滤液。（可选步骤）以同样的方法再用 0.7 ml Buffer W2 洗涤一次 12,000xg 离心 1 min。
 

~undefined  确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 

7.  将制备管置于 2 ml 离心管中，12 000xg 离心 1 min。
 

8.  将制备管置于洁净的 1.5 ml  离心管中，在 DNA 制备膜正中央加 25-30 ul  水或 Eluent，室温静置1 min。12 000xg 离心 1 min 洗脱 DNA。

1.  在步骤 1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型 DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含 DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对 DNA造成的损伤。
 

2.  在步骤 2 中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响 DNA 回收率。
 

3.  将 Eluent 或水加热至 65℃，有利于提高洗脱效率。
 

4. DNA 分子呈酸性，建议在 2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5 洗脱液中保存。