感受态细胞制备/转化

摘要： 人工构建的质粒缺乏转移必需的基因,不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移.这时就需要诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外DNA.

质粒制备的必要,人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移.如需将质粒载体转移进受体 细菌 ,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA .

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是 微生物 遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验基因细胞. 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和甲基化 酶的突变体(Rˉ,Mˉ)。

它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代.受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后。

细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Compenent cells).

进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状.将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞).

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛.

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：

1. 细胞生长 状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养的细菌,最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制.DH5α菌株的OD600 为0.5时, 细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的细菌情况有所不同),这时比较合适.密度过高或不足均会影响转化效率.

2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA).转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低.1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和.一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％.

3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处.

4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦.

　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化.由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过Amp抗性来筛选转化子.如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长.能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS.

转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定.

本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化.由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过Amp抗性来筛选转化子.如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp的培养基上不能生长.能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS.转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定.