用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌

摘要： 本文主要介绍了用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的实验方法.下面的方法是对Cohen等于1972年发表的方法更为便捷的修改.

下面的方法是对Cohen等于1972年发表的方法更为便捷的修改.这一方法可以用于批量制备感受态细胞,其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆/ug超螺旋质粒 DNA .这个转化效率对于方便地进行 质粒 中克隆已经足够高了.用此方法制备的感受态细胞可以在-70℃冻存.但随着冻存期的延长, 转化 效率会有所降低. 材料：

缓冲液和溶液： CaCl2.2H2O(1mol/L)：

制备 感受态细胞 是,取出1 ml贮存液加90ml纯水稀释至100ml,用预先处理的Nalgene滤膜（0.45um孔径）过滤除菌,放置冰上.

或 标准的转换缓冲液（TFB）：

对许多 大肠杆菌 的在军中,用标注TFB代替CaCl2可获得一致或更好的结果

MgCl2-CaCl2溶液,冰上预冷

培养基：

B或SOB培养液（培养最初的 细胞生长 物）：

SOB琼脂糖,含20mmol/L MgSO4和适当的 抗生素 .

标准的SOB琼脂板含10mmol/L MgSO4

SOC培养液 ：

每个转化反应约需1ml.

核酸和寡核苷酸：

质粒DNA（重组质粒）

离心机和转头：

Sorvall GSA 转头或与之相当的转头

专用设备：

聚丙烯管（50mm）,冰上预冷

聚丙烯管（17*100mm；Falcon2059）,冰上预冷

可调至42℃的水浴装置

方法：

重要： 本方案的所有操作都必须在无菌条件下进行.

制备感受态细胞：

1、 从37℃培养16-20h的平板中挑取一个单菌落（直径2-3mm）,转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中.于37℃剧烈振摇培养3h.一般经验,1OD600约含有大肠杆菌DH1×109个/ml .

为达到高效转化,活细胞数务必少于108 细胞/ml,对于大多数大肠杆菌来说,这相当于OD600值为0.4左右.为保证 细菌 培养物的生长密度不致过高,可每隔15-20min测定OD600 来监测,用监测的时间及OD600 列一个图表,以便预测培养物OD600值达到0.4的时间,当OD600值达到0.35时,收获细菌培养物.

在菌株和菌株之间,OD600值与每毫升活细胞数见的关系变化很大,因此有必要通过测定特异大肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值,并将各稀释浓度的培养物铺于物抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞数,从而使分光光度计读数得到标准化.

2、 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中,在冰上放置10min,使培养物冷却至.0℃.

3、 于4℃用Sorvall GS3 转头以4100r/min离心10min,以回收细胞.

4、 倒出培养液,将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽.

5、 每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀.