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DNA实验

FISH和PRINS技术

2024-09-21 DNA实验 加入收藏
FISH和PRINS技术关键词: FISH PRINS来源: 互联网一、荧光原位杂交(FISH)是一种简单、敏感、而容易操作的方法,结果迅速,并能在同一标本上检

FISH和PRINS技术

关键词: FISH PRINS来源: 互联网

一、荧光原位杂交(FISH)

是一种简单、敏感、而容易操作的方法,结果迅速,并能在同一标本上检测多个不同的基因,可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。

FISH技术是利用特异的DNA探针,标记了生物素,地高辛、或荧光素,对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交,并用荧光法显示。

FISH实验步骤

试剂配制:

(1)变性液(70%甲酰胺 + 2×SSC,pH7.0):4 ml 20×SSC;8 ml 蒸馏水;28 ml 甲酰胺。每次新鲜配制。

(2)杂交后洗涤液: 20×SSC 4 ml;蒸馏水16 ml;甲酰胺20 ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。

1. 用硅化玻片,石蜡切片,60℃烤片过夜。二甲苯脱蜡至酒精,斜置切片,空气中干燥。

2. 蛋白酶处理:

(1)每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40 ml 倒入Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。

(2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。

(3) 2×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1 min。

(4)梯度酒精脱水(-20℃预冷),空气中干燥。

3. 变性:

(1)每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液;

(2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

(3)78℃孵育8 min;

(4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2 min;

(5)空气干燥。

4. 杂交:

(1)准备探针;

(2)取一个较大的湿盒,交叉放置切片;

(3)滴10 μl 探针在切片的组织上,加盖玻片;

(4)盖上湿盒盖,37℃孵育12~16 h。

杂交后水洗:

(5)镊子小心去除盖玻片;

(6)43℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min;

(7)2×SSC(37℃)洗两次,每次10 min;

(8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥。

检测:

(9)从1×PBS中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理4张切片。

(10)每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素,室温下孵育20 min;

(11)去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2 min。

扩增:

(12)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;

(13)每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20 min;

(14)去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2 min;

(15)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;

(16)每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20 min;

(17)1×PBS室温下洗3次,每次2 min。

5. 细胞核染色:

(1)张切片加10~20 μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml;

(2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

二、用引物介导的原位标记(PRINS)

是PCR和荧光原位杂交(FISH)的结合, PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列,在聚合酶的驱动下,带有标记的脱氧核苷酸(FITC-dUTP或半抗原-dUTP)和dATP、dCTP、dGTP的延伸,依赖标记,新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC,用荧光显微镜观察。

PRINS实验步骤

1. 常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS;

2. 用0.2 mol/L 盐酸处理5min;

3. 蛋白酶K(25 μg/ml)消化37℃ 15 min;

4. 分别用80%,95%和100%酒精脱水,室温干片;

5. 加PCR混合液25 μL(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,各加200 μmol/L dATP,dCTP,dGTP,1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl,引物250 ng,Taq DNA聚合酶2 U),加盖片;

6. 94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min;

7. 用0.1×SSC液,65℃洗5 min;

8. 片于65℃ 10~20 s;用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min,2次;

9. 经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min;

10. 加地高辛抗体复合物(1:500)室温下2 h;

11. BufferⅢ液洗5 min;

12. 用BCIP-NBT显色1~2 h,在镜下控制,终止显色;

13. 用中性红或核固红衬染,酒精脱水,二甲苯透明,树脂封片。


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