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DNA实验

用于 PCR 的模板 DNA 制备实验(含血标本)

2024-05-25 DNA实验 加入收藏
材料与仪器步骤1. 3 ml 外周血或 1 ml 骨髓液放入含 50 μl 0.5mol/L EDTA 的无菌离心管(15 ml 管)中。2. 2000 r/m


材料与仪器

步骤


1. 3 ml 外周血或 1 ml 骨髓液放入含 50 μl 0.5mol/L EDTA 的无菌离心管(15 ml 管)中。


2. 2000 r/min 离心 10 min。吸去血浆,用指弹匀剩余的有核细胞和红细胞,加入红细胞溶解液 10 ml 并混匀,常温下放置 30 min。红细胞溶解液配制:NH4Cl 4 g,NH4ClO4 3 g,NH4HCO3 0.04 g,加水定容至 1L;灭菌;4℃ 下保存。


3. 2000 r/min 离心 2 min,此时有核细胞成白色团块沉淀于管底。倒出已溶解的红细胞液体,然后用少许红细胞溶解液轻轻清洗剩余红细胞液体并倒出。


4. 用指弹匀沉淀的有核细胞团块,加入 3 ml 组织裂解液并弹匀,37℃ 下放置 30 min 以上。骨髓标本中若含有组织块,可加入 10 μl 蛋白酶 K 以助裂解。


5. 无菌尖头刀片刮下,放入 300~900 μl 组织裂解液中,并加入 20 mg/ml 蛋白酶 K(PK)10~15 μl,封口膜封口,置 55℃ 3 h 以上。


6. 其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀,再加入 5~10 μl 蛋白酶 K,直至无沉淀已澄清为止。


7. 灭活蛋白酶 K 裂解液中含有蛋白酶 K,需放入沸水中 10 min 以灭活蛋白酶 K。


8. 沉淀蛋白质按裂解液量的 1/3 加入蛋白质沉淀液(饱和乙酸钠)并混匀,14500r/mm 离心 15 min。此时,蛋白质沉于管底,DNA 溶解于上清液中。


9. 析出 DNA 取上清液并加入等量冷异丙醇,充分混匀,新鲜标本此时可见 DNA 丝缠绕成团析出。若新鲜标本童太少或固定组织因 DNA 片段较小,无法用肉眼见到 DNA 成团析出,需 14500 r/min 再离心 10 min,一般 DNA 可见于管底。



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