探针的纯化

某些标记探针必须经纯化后方可使用。这是因为在探针标记过程中，反应液中仍存在一些未被结合到探针中去的剩余dNTP等小分子。 为将掺入并结合到cDNA，cRNA和标记寡核苷酸与游离的标记寡核苷酸分开，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法进行纯化。 乙醇沉淀法的原理是：DNA可被乙醇沉淀，而未掺入DNA的dNTP则保留在上清液中，由此反复乙醇沉淀能将两者分开。 核酸溶液中去除蛋白质的酚/氯仿抽提法的原理是：交替使用酚，氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质杂质的效果。 因为酚虽能有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15% 的水，从而溶解一部分ploy（A）RNA。 为克服这两方面的局限，混合使用酚与氯仿，对于RNA提取，显得更加重要，氯仿还能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。