定量菌悬液、孢子悬液、芽孢悬液 制备方法

在进行低浓度定量菌株菌悬液制作时，通常使用十倍或百倍稀释法进行制作。

十倍稀释法的具体操作步骤

1.将生理盐水（或磷酸盐缓冲液等）分装至试管中，每支装量为9mL（百倍稀释可用10mL，特殊情况也可使用9mL做近似百倍稀释），进行灭菌处理（121℃灭菌15-30min即可）；注：在进行厌氧菌（如生孢梭菌，产气荚膜梭菌）稀释时，选用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液做为稀释剂效果更佳；若不在厌氧环境中操作，从开始稀释至使用菌悬液结束要控制在15min以内，时间过长会导致菌体死亡。

2.将灭菌后装有9mL生理盐水的试管编号1，2，3，4，5，6，7，8。

3.将一定量的菌加入至编号1的试管中制成第一稀释梯度菌悬液（通常称为10-1梯度），使用旋涡振荡器混匀。

4.吸取1mL10-1梯度菌悬液至编号2的试管中，混合均匀，就得到了第二稀释度的菌悬液（通常称为10-2梯度，若吸取10-1梯度菌悬液100μL至10mL生理盐水管中，即为百倍稀释，可以直接得到10-3梯度菌悬液）。

5.以此类推，可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度菌悬液，每一支管的含菌量都是前一直管的1/10，第8支管的菌液浓度就是第1支管的千万分之一了，如果第一支试管含菌量是109CFU/mL，第8支管就可以得到100CFU/mL左右浓度的菌悬液了。制备第一支试管的菌悬液及确定第一支试管中菌液的浓度，一般采用以下四种方法：

• 麦氏比浊法

将一定量培养好的细菌转移到第一支试管中(可以用菌液，可以挑取菌落），制备成约5麦氏浊度的均一浑浊菌悬液（约109CFU/mL）。优点：新手可直接上手操作。缺点：不同细菌体积大小有差别，有些芽孢菌容易聚成团块不易制得均一悬液；不适用于真菌孢子悬液制备。注意事项：不同细菌的麦氏浊度与浓度之间存在差异，第一次试验之前最好先进行验证；麦氏浊度无法区分细菌死活，因此最好使用新活化的菌制备；真菌（酵母菌）体积较大，同等浊度下浓度约为细菌的1/20。

• 吸光度法

细菌在600nm波长处具有最大吸光度，在一定浓度下，细菌的浓度与OD600nm呈正比关系，因此可以通过测量OD600nm值来确定菌悬液浓度。此方法更常用于测定菌液浓度（观察细菌生长曲线），也可在制备105-107CFU/mL的菌悬液时使用，不适用于低浓度菌悬液制备。

• 菌液稀释法

将菌株接种至非选择性肉汤培养基中过夜培养，吸取1mL培养物至9mL生理盐水中制成10-1梯度菌悬液（约108CFU/mL），稀释至10-6或10-7即可得到10-100CFU/mL菌悬液。优点：操作简单缺点：菌数不稳定，受细菌种类、培养基影响较大；仅适合均匀浑浊生长的细菌或真菌；若培养过程发生污染，不易察觉。注意事项：不同菌株生长时间不同，在不同培养基中生长浊度也不同，如大肠埃希氏菌、金黄色葡萄菌、沙门氏菌等在TSB中过夜培养即可，乳酸菌通常需在MRS肉汤中培养48-72h，酵母菌、白色念珠菌需在SDB培养基中培养3-5天。酵母菌、芽孢菌通常在10-5稀释度左右，就可以得到10-100CFU/mL的菌悬液。

• 菌苔稀释法

从平板或斜面上挑取一定量的菌苔（2-3mm单个菌落，菌落偏小可多挑几个菌落）至9mL生理盐水中振荡均匀，制成10-1梯度菌悬液（约108CFU/mL），稀释至10-7或10-8即可得到10-100CFU/mL菌悬液。优点：操作简单，相比较于其他稀释方法，最大优势就是更容易准确控制菌数浓度；适用范围广，细菌、真菌均可采用此方法制备菌悬液。缺点：需要尝试和经验注意事项：不同菌株制成的菌悬液浓度同样存在差异，初次进行特定菌株稀释时需要做验证；一般非芽孢细菌制成的10-1梯度菌悬液约为108-109CFU/mL，而芽孢菌和酵母菌制成的10-1梯度菌悬液约为106-107CFU/mL。初次进行菌液制备时，可以选用方法1和方法4，多做几个稀释度测试，熟练有经验后使用方法4进行菌液制备，可轻松准确制得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL浓度菌悬液。制备好的菌悬液可在验证过的时间内使用，使用时间一般与稀释剂有关，接下来我们再来讲一下稀释剂的选择和应用：1.0.85%生理盐水或0.9%氯化钠溶液在国标中通常使用0.85%生理盐水，中国药典中常使用0.9%氯化钠溶液，二者效果无明显差别，可适用于绝大多数细菌或真菌的菌悬液或孢子悬液制作（孢子悬液较稳定一般可在2-8℃存放一个月或者更长时间）。2.磷酸盐缓冲液与生理盐水效果接近，可用于菌悬液制备和稀释，但更常用于样品的稀释。3.0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液相比较于生理盐水，此两种缓冲液对于产气荚膜梭菌、生孢梭菌等厌氧菌的效果更好，更能保持细菌的活性。该培养基因含有少量蛋白胨，细菌易发生繁殖导致菌数发生变化，通常制备的菌悬液需在短时间内使用（一般细菌建议在45min内使用，厌氧菌建议在15min内使用）。

霉菌的孢子悬液制备将霉菌接种至沙氏琼脂（或马铃薯葡萄糖琼脂）斜面（或平板）进行培养至产丰富的孢子，加入稀释剂进行洗脱（也可用接种环直接挑取一环孢子至稀释液中），再用十倍或百倍稀释法制成适宜浓度菌悬液。
注意事项：（1）培养过程中不可密封培养，保持良好的透气性有利于霉菌的生长和产孢子；（2）不同的培养基营养存在差别，霉菌生长后期，培养基内的营养逐渐耗尽后，霉菌倾向于开始产孢子，因此在培养过程中不同培养基产孢子时间存在差异；（3）孢子容易在空气中漂浮扩散，因此若采用接种环挑取孢子时，应做好防扩散污染的措施。

芽孢悬液制备将芽孢菌接种至硫酸锰营养琼脂（或其他产芽孢培养基）36±1℃培养5-7天（或其他合适温度培养），刮取菌苔至稀释液中制成悬液，将菌悬液置于65℃中水浴30min（或沸水浴10min）杀死菌体，再用十倍稀释或百倍稀释法制成适宜浓度的芽孢悬液。
注：制备好的菌悬液原则上应现制现用，但孢子悬液、芽孢悬液相对比较稳定，可以在2-8℃保存较长时间，可在经过验证的期限内使用。