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DNA实验

定量菌悬液、孢子悬液、芽孢悬液 制备方法

2021-07-28 DNA实验 加入收藏
在进行低浓度定量菌株菌悬液制作时,通常使用十倍或百倍稀释法进行制作。十倍稀释法的具体操作步骤1.将生理盐水(或磷酸盐缓冲液等)分装至试管中,每支装量为9mL(百倍稀释可用10mL,特殊情况也可使用9mL做近似百倍稀释),进行灭菌处理(121℃灭菌15-30min即可);注:在进行厌氧菌(如生孢梭菌,产气荚膜梭菌)稀释时,选用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液做为稀释剂效果更佳;若不在厌

在进行低浓度定量菌株菌悬液制作时,通常使用十倍或百倍稀释法进行制作。

十倍稀释法的具体操作步骤

1.将生理盐水(或磷酸盐缓冲液等)分装至试管中,每支装量为9mL(百倍稀释可用10mL,特殊情况也可使用9mL做近似百倍稀释),进行灭菌处理(121℃灭菌15-30min即可);注:在进行厌氧菌(如生孢梭菌,产气荚膜梭菌)稀释时,选用0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液做为稀释剂效果更佳;若不在厌氧环境中操作,从开始稀释至使用菌悬液结束要控制在15min以内,时间过长会导致菌体死亡。

2.将灭菌后装有9mL生理盐水的试管编号1,2,3,4,5,6,7,8。

3.将一定量的菌加入至编号1的试管中制成第一稀释梯度菌悬液(通常称为10-1梯度),使用旋涡振荡器混匀。

4.吸取1mL10-1梯度菌悬液至编号2的试管中,混合均匀,就得到了第二稀释度的菌悬液(通常称为10-2梯度,若吸取10-1梯度菌悬液100μL至10mL生理盐水管中,即为百倍稀释,可以直接得到10-3梯度菌悬液)。

5.以此类推,可以得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度菌悬液,每一支管的含菌量都是前一直管的1/10,第8支管的菌液浓度就是第1支管的千万分之一了,如果第一支试管含菌量是109CFU/mL,第8支管就可以得到100CFU/mL左右浓度的菌悬液了。制备第一支试管的菌悬液及确定第一支试管中菌液的浓度,一般采用以下四种方法:

  • 麦氏比浊法

将一定量培养好的细菌转移到第一支试管中(可以用菌液,可以挑取菌落),制备成约5麦氏浊度的均一浑浊菌悬液(约109CFU/mL)。优点:新手可直接上手操作。缺点:不同细菌体积大小有差别,有些芽孢菌容易聚成团块不易制得均一悬液;不适用于真菌孢子悬液制备。注意事项:不同细菌的麦氏浊度与浓度之间存在差异,第一次试验之前最好先进行验证;麦氏浊度无法区分细菌死活,因此最好使用新活化的菌制备;真菌(酵母菌)体积较大,同等浊度下浓度约为细菌的1/20。

  • 吸光度法

细菌在600nm波长处具有最大吸光度,在一定浓度下,细菌的浓度与OD600nm呈正比关系,因此可以通过测量OD600nm值来确定菌悬液浓度。此方法更常用于测定菌液浓度(观察细菌生长曲线),也可在制备105-107CFU/mL的菌悬液时使用,不适用于低浓度菌悬液制备。

  • 菌液稀释法

将菌株接种至非选择性肉汤培养基中过夜培养,吸取1mL培养物至9mL生理盐水中制成10-1梯度菌悬液(约108CFU/mL),稀释至10-6或10-7即可得到10-100CFU/mL菌悬液。优点:操作简单缺点:菌数不稳定,受细菌种类、培养基影响较大;仅适合均匀浑浊生长的细菌或真菌;若培养过程发生污染,不易察觉。注意事项:不同菌株生长时间不同,在不同培养基中生长浊度也不同,如大肠埃希氏菌、金黄色葡萄菌、沙门氏菌等在TSB中过夜培养即可,乳酸菌通常需在MRS肉汤中培养48-72h,酵母菌、白色念珠菌需在SDB培养基中培养3-5天。酵母菌、芽孢菌通常在10-5稀释度左右,就可以得到10-100CFU/mL的菌悬液。

  • 菌苔稀释法

从平板或斜面上挑取一定量的菌苔(2-3mm单个菌落,菌落偏小可多挑几个菌落)至9mL生理盐水中振荡均匀,制成10-1梯度菌悬液(约108CFU/mL),稀释至10-7或10-8即可得到10-100CFU/mL菌悬液。优点:操作简单,相比较于其他稀释方法,最大优势就是更容易准确控制菌数浓度;适用范围广,细菌、真菌均可采用此方法制备菌悬液。缺点:需要尝试和经验注意事项:不同菌株制成的菌悬液浓度同样存在差异,初次进行特定菌株稀释时需要做验证;一般非芽孢细菌制成的10-1梯度菌悬液约为108-109CFU/mL,而芽孢菌和酵母菌制成的10-1梯度菌悬液约为106-107CFU/mL。初次进行菌液制备时,可以选用方法1和方法4,多做几个稀释度测试,熟练有经验后使用方法4进行菌液制备,可轻松准确制得10-100CFU/mL或20-200CFU/mL浓度菌悬液。制备好的菌悬液可在验证过的时间内使用,使用时间一般与稀释剂有关,接下来我们再来讲一下稀释剂的选择和应用:1.0.85%生理盐水或0.9%氯化钠溶液在国标中通常使用0.85%生理盐水,中国药典中常使用0.9%氯化钠溶液,二者效果无明显差别,可适用于绝大多数细菌或真菌的菌悬液或孢子悬液制作(孢子悬液较稳定一般可在2-8℃存放一个月或者更长时间)。2.磷酸盐缓冲液与生理盐水效果接近,可用于菌悬液制备和稀释,但更常用于样品的稀释。3.0.1%蛋白胨水或pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液相比较于生理盐水,此两种缓冲液对于产气荚膜梭菌、生孢梭菌等厌氧菌的效果更好,更能保持细菌的活性。该培养基因含有少量蛋白胨,细菌易发生繁殖导致菌数发生变化,通常制备的菌悬液需在短时间内使用(一般细菌建议在45min内使用,厌氧菌建议在15min内使用)。

霉菌的孢子悬液制备将霉菌接种至沙氏琼脂(或马铃薯葡萄糖琼脂)斜面(或平板)进行培养至产丰富的孢子,加入稀释剂进行洗脱(也可用接种环直接挑取一环孢子至稀释液中),再用十倍或百倍稀释法制成适宜浓度菌悬液。
注意事项:
(1)培养过程中不可密封培养,保持良好的透气性有利于霉菌的生长和产孢子;(2)不同的培养基营养存在差别,霉菌生长后期,培养基内的营养逐渐耗尽后,霉菌倾向于开始产孢子,因此在培养过程中不同培养基产孢子时间存在差异;(3)孢子容易在空气中漂浮扩散,因此若采用接种环挑取孢子时,应做好防扩散污染的措施。

芽孢悬液制备将芽孢菌接种至硫酸锰营养琼脂(或其他产芽孢培养基)36±1℃培养5-7天(或其他合适温度培养),刮取菌苔至稀释液中制成悬液,将菌悬液置于65℃中水浴30min(或沸水浴10min)杀死菌体,再用十倍稀释或百倍稀释法制成适宜浓度的芽孢悬液。
注:制备好的菌悬液原则上应现制现用,但孢子悬液、芽孢悬液相对比较稳定,可以在2-8℃保存较长时间,可在经过验证的期限内使用。


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