1. RNA探针

RNA探针的长度以50-150碱基为佳，探针易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。长500个碱基的探针杂交时间约需20个小时左右，如超过500个碱基的RNA探针则在杂交前用有限碱基水解法控制其长度。

（1）孵育时间t = Lf- Lo / K × Lo ×Lf （Lo=核酸探针原长度（kb），Lf=核酸探针水解后所需长度（kb），K是常数率=0.11 kb/min）。

（2）在室温中加入下列试剂终止水解：3 mol/L醋酸钠，6.6 μl（终浓度0.1 mol/L），醋酸1.3 μl（终浓度为0.5%）。

（3）加入下列试剂沉淀探针：7 mol/L醋酸铵100 μl，100%乙醇 750 μl，RNA （10 mg /ml） 2 μl ，置 -20℃ 2 小时后恢复到室温，在1400 rpm离心30 min。

（4）小心将乙醇倒出，待试管内干燥后再用无菌ddH2O稀释到10 ng/μl浓度。

（5）最终探针长度可于10% 聚丙稀酰胺凝胶在60℃ 的尿素中电泳检测。

2. 探针的长度

原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。

最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5 ng/μl，而非放射性标记cRNA探针的浓度1.0 ng/μl 。杂交液的量要适当，每张切片以30-50 μl为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。

3. 杂交的温度和时间

设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度（melting temperature Tm）20-30℃。

多数RNA原位杂交Tm为95℃，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1% 甲酰胺浓度可降低0.72℃。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。

杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰胺的电离作用。