基因诊断--　基因诊断的原理

第十三章　基因诊断

长期以来，单基因遗传病的诊断主要靠临床观察和系列化学检查，但生化学检查要求有相应基因表达产物的体液或细胞，并对基因产物或代谢异常机理有所了解，但对绝大多数遗传病而言，目前还远未达到这种认识。

　　理想的诊断方法是对患者基因或DNA本身直接进行分析，因为这种分析摆脱了上述各种限制。机体各种组织的核细胞均有全套 基因组 DNA，都可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题。例如，淋巴细胞、皮肤细胞、绒毛细胞均可用来分析β珠蛋白基因而不一定要采用骨髓细胞；又如苯酮尿症时缺乏的苯丙氨酸羟花酶只在肝中产生，但任何组织、细胞的DNA均可用作苯丙氨酸羟化酶基因的检查。当然，基因分析也不能完全代替生化学检测。例如，G6PD缺乏症的诊断只需要作红细胞酶测定，而不需要基因分析作出诊断。

第一节　基因诊断的原理

核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。由此可见，进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。

一、基因探针

基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。

1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。

　　2．探针的制备 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运 载体 （噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。

为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。

寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。

3.探针的标记 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nick translation)，其原理如图13－1。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。

图13-1 缺口平移标记法粗线示标记部分

探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。

二、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶（restriction endonuclease），又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段.限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。

限制酶主要来源于原核生物，是一组能水解DNA磷酸二酯键的酶。迄今已发现的限制酶多达数百种，分为三类。在基因工程中使用的主要是第二类。限制酶根据其来源命名。例如，限制酶EcoRⅠ来源于大杆菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在该菌株中分离的第一个限制酶。

下面是一些最常用的限制酶的来源及其识别顺序(表13-1)

每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点(restriction sites)或切点.限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端（cohesive terminus）；第二种为平整切割，即两

表13-1 常用的限制酶的来源及其识别顺序列

名称

识别序列

来源 Ava C↓( C )CG( A )G T G Anabaena variabilis Bam H G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciens H Bgl Ⅱ A↓GATCT Bacillus globigii Eco RⅠ G↓ * ATTC A Escherichia coliRY13 Eco RⅡ ↓CC( A GG T Escherichia coliR245 HaeⅢ GG↓ * C C Haemophilus aegyptius HindⅢ * ↓AGCTT A Hemophilus influenzae Rd HpaⅠ GTT↓AAC Haemophilus parainfluenzae HpaⅡ C↓ * GG C 同上 KpnⅠ GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae MboⅠ ↓GATC Moraxella bovis PstⅠ CTGCA↓G Providencia stuartii

*被甲基化