在质粒载体中进行平末端片段的克隆
1、分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1－10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。2、苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体
1、分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1－10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。
2、苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。
3、分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。假设1 bp相当于660Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。
4、将载体DNA去磷酸化。
5、按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5ml离心管：
管号 | DNA |
A和E | 载体1 [60fmol (~100ng)] |
B | 外源插入片段2 [60fmol (~10ng)] |
C和F | 载体1 （60fmol）和外源插入片段3 （60fmol） |
D | 线状载体（5’-磷酸化）（60fmol） |
G | 环状载体[60fmol (~10ng)] |
1 载体DNA 已进行去磷酸化
2 外源目的DNA 可以连接接头。
3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA 片段摩尔比一般为1：1。DNA 的总浓度应约为10ng/μl。
（1）A、B和C管中加入：
10×连接缓冲液 1.0μl
T4噬菌体连接酶 0.5 Weiss单位
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 补至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
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