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DNA实验

原位分子杂交技术在电镜水平的应用

2024-09-27 DNA实验 加入收藏
第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用  自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来近20余年内,这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学

第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用

  自Gall和Pardue建立了原位杂交技术以来近20余年内,这一技术为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病毒学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料,发挥了其它技术难以取代的作用。近年来,此一技术的应用领域逐渐扩大并在两个主要进行了技术法的改进。一方面是应用一系列放大手段增强检测的灵敏度(详见二十二章 ),另一方面是提高其分辨率,即向电镜水平发展。Jacob(1971)首先用 3 H标记的核酸RNA探针与DNA杂交并在电镜水平显示获得成功,继后不少科技工作者在这方面做了大量的工作(Manning et al 1975,Steinert et al 1976,Hutchison et al 1982)。但所应用的均是同位素标记核酸探针,直到1986年Binder首先用生物素标记的rDNA及UI探针,在蜂蝇(Drosophila)卵巢,应用Lowicryl-K4M低温包埋的切片上进行原位分子杂交,以蛋白A和胶体金复合物作为显示系统,较好的保存了组织的形态学结构和较高的信噪比例。Webster等人(1986)应用生物素标记探针显示了细胞内mRNA的分布。Singer等(1989)成功的用双标记原位杂交技术,一方面检测整装抽提细胞内与骨架结合的mRNA,同时显示了该mRNA所表达的蛋白质。新近Fischer等利用地高辛标记rRNA探针在Lowicryl-K4M包埋的切片进行杂交,然后以抗地高辛等抗体结合胶体金颗粒进行显示,以银显示法加强获得极为满意的定位。总之,电镜水平的原位分子杂交技术在国外还处在不断提高和改进的阶段,在国内此一技术还刚起步。焦仁杰等(1992)报告了以生物素标记腺病毒的 基因组 探针与整装抽提的细胞进行电镜原位杂交技术,成功地证明了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系,胶体金颗粒呈簇状与串珠状结合在核骨架上。向正华等(1994)应用地高辛标记探针结合HRP的包埋前染色法显示了POMc mRNA定位于神经元的粗面内质网上。下面列举几种代表性的电镜原位杂交技术。

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al, 1982)

(1)将整封染色体铺片放置于金网上,在70%的酒精蒸汽固定4~15h,空气干燥。

(2)以强碱使DNA变性,将金网置于2×SSC内(应用0.1n NaOH调整至pH12),室温,2min。

(3)脱水,以70%和95%酒精各冲洗3次,空气干燥。

(4)杂交,金网覆于平面玻璃皿( Petri dish)内的杂交液滴上,每滴约10~15μl,将此小碟置于盛于杂交缓冲的大塑料盒内,保持湿润,在60~65℃孵育4~24h。

  杂交液的配制:6×SSC或6×TNS(1×TNs =0.1mol/L NaCl, 0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000~50000cpm/10μl 3 h cRNA)。

(5)杂交后冲洗,金网自杂交液中取出后立即用大量的2×SSC冲洗多次。RNA酶溶液(20μg/ml)室温冲洗,然后再用2×SSC室温冲洗,冲洗后梯度酒精脱水(70%,95%)空气干燥。

(6)浸入乳胶膜,应用L-4核乳胶液,水稀释4倍。浸膜后的金网,用胶带固定在载玻片上放在密封的黑色塑料盒内,4℃,时间根据同位素种类和靶mRNA含量而定,也可选择不同时间曝光,根据显影强弱确定最终显影的时间。

(7)显影。暗盒自冷房或冰箱中取出后,在室渐中回暖至少30min,以防核乳胶膜皱缩。然后在显影液(Kodax Microdol X)显影3~5min,温度18~24℃。水冲,在15% Kodax快速定影液定影5min,然后在空气中干燥。

所有溶液应尽可能新鲜配制。

(8)电镜观察。

二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术

(一)基本原理

  应用DNA探针缺口翻译(nick translation)方法,通过碱基配对以一条DNA链为模板,将生物素标记的某一种脱氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP渗入有缺口的DNA链。将生物素标记的DNA探针与细胞或组织进行原位杂交。显示方法有二种:一种是用HRP显示,类似免疫电镜技术中采取的包埋前染色法,利用地高辛-过氧化物酶HRP显色法进行光镜水平的厚片原位杂交免疫细胞化学染色,其步骤与第二十章 叙述的原位杂交免疫细胞化学基本方法相同,只是为了减少细胞微细结构的损伤,在包埋过程中减少H 2 O 2 和Triton X-10等易损伤细胞与组织结构的 试剂 用量(向正华等1993)。在显色完毕后,取反应阳性部位按常规电镜操作程序进行锇酸后固定,脱水,包埋,切片和观察。此法利用HRP免疫反应产物具有极高电子反应密度体积大小不一,加之非特异性反应产物常掩盖微细结构的背景,不易达到准确的定位。现在比较广泛应用的是生物素-蛋白A(PA)胶体金(gold)标记技术。用于原位杂交的电镜定位,取得较为满意的效果。其基本原理是利用生物素标记探针与细胞或组织进行原位杂交后,利用抗生物素抗体-结合蛋白A-金标记杂交体的超微结构定位,类似免疫电镜中的包埋后染色。在包埋剂应用方面,有报告应用环氧树脂包埋获得成功的。但大多数较满意的结果均获自低温亲水性包埋剂――Lowicryl-K4M,也有应用LR-white作为包埋剂的(详见第七章 )。

(二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术(Binder et al,1986)

1.固定  现认为应用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸缓冲液中(pH7.4),为较理想的固定剂,也有主张单纯用4%多聚甲醛的,因经实验证明如应用高浓度4%的戊二醛比用多聚甲醛样品其杂交率减低60%。但作者认为应用少量戊二醛可较好的保持细胞的微细结构。也有报告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定时间在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS,在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸缓冲液中储存过夜。

2.脱水  次日,用0.15mol/L磷酸缓冲液(pH7.4)冲洗30min,然后进行脱水,①65%乙二醇,0℃,60min;②80%乙醇-35℃,120min;③100%K4M:80%乙醇 =1:1,-35℃,120min;④100%K4M:80%乙醇=2:1,-35℃,60min;⑤100%K4M -35℃,过夜。

3.包埋 按照Roth et al(1981),组织块包埋于盛有K4M的胶囊中,在-35℃紫外线灯(波长360nm)照射聚合24~48h。取出后置室温,用紫外线灯继续照射24h,使变硬易于进行超薄切片。胶囊短期可保存于室温,如需长期保存,宜置于-70℃冰箱中,可保存近1年。

K4M配制(中等硬度)

交联接剂(cross-linker)  2.7mg

单体(monomer)      17.3mg

引发剂(initiator)    0.10mg

可根据硬度需要调整各化合物比例。增加交联剂的量,组织块的硬度增加。

4.切片超薄切片50~60nm,捞于有覆有Formavar和碳膜的镍网上。

5.组织前处理和预杂交用含0.2mol/l Tris缓冲液的0.1mol/L甘氨酸(Ph7.4)冲洗15min,以除去醛类固定剂对杂交和检测的影响,然后2×SSC冲洗15min,再用变性液(70%去离子甲酰胺,2×SSC)在65℃处理样品5~10min,以达到变性的目的。变化后的样品在预杂交液中(50%去离子甲酰胺,0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,pH7.5)37℃预处理15min。

6.杂交镍网载有切片面覆盖于杂交液滴(约20μl)上,置于湿盒内37℃,1~2h。杂交液成份与光镜原位杂交免疫细胞化学相同(详见第二十章 ),如为DNA探针须在沸水中先煮2~3min,以使之变性,然后迅速移至冰浴。

整个杂交过程须注意防止镍网上的杂交液干掉。

7.杂交后漂洗

含50%甲酰胺的2×SSC液  37℃  30min

含50%甲酰胺的1×SSC液室温30min

无甲酰胺的1×SSC液室温20min

样品置1×SSc        4℃过夜

0.01mol/L PBS(pH7.2) 室温  10min

4%BSA   封闭   15min

  8.羊抗生物素IgG抗体(sigma)1:100(稀释用PBS液:2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH 2 PO 4 , 0.278% Na 2 HPO 4 ,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室温反应2h。

9.含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。

10.兔抗羊IgG的IgG相连10nm胶体金(Sigma


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