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DNA实验

酶切实验

2024-06-13 DNA实验 加入收藏
原理采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单,但双酶切如果两种酶所用缓


原理

采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单,但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同,这时可以采用如下措施解决:1)先用一种酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切;2)先进行低盐要求的酶酶切,然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求,加入第二种酶进行酶切;3)使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行,尽量避免星号活力。

材料与仪器

质粒DNA
限制性核酸内切酶 蒸馏水
微量移液枪 离心机 电泳仪 水浴锅 紫外透射观测仪 离心管 记号笔

步骤

一、实验材料准备
 
1.  材料:质粒DNA。
 
2.  试剂:限制性内切酶、ddH2O。
 
3 .  仪器:微量移液枪,离心机,水浴锅, 电泳仪,紫外透射观测仪。
 
二、单酶切

1.  在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:

(1)质粒DNA:X uL(约1 ug)。

(2)限制性内切酶:1 uL(约10 U)。

(3)10xbuffer:2 uL。

(4)ddH2O:补足20 uL。

2.  混匀,做好标记。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反应。

5.  电泳检测酶切效果。

三、双酶切

1.  在1.5 mL灭菌离心管中依次加入:

(1)质粒DNA:X uL(约1 ug)。

(2)限制性内切酶1:1 uL(约10 U)。

(3)限制性内切酶2:1 uL(约10 U)

(3)10xbuffer:1或2 uL。

(4)ddH2O:补足20 uL。

2.  混匀,做好标记。

3.  37℃水浴1-3 h。

4.  70℃水浴10 min中止反应。

5.  电泳检测酶切效果。

四、结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底,紫外灯下检测电泳结果,则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样(超螺旋、线性和开环三条带),则说明质粒完全没有被切开。

注意事项

1.  酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系,这样抑制因素得以稀释;基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大,一般为1 ug/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10,否则甘油浓度会超过5%,会产生星号活力;对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4―5hr, 甚至过夜。灭活限制性内切酶活性可以采用加热灭活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活,这一点需要注意。

2.  双酶切体系缓冲液添加量要根据两种限制性内切酶最佳缓冲体系,可以登录限制性内切酶购买公司官方查看。


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