Active Motif ChIP 技术专家经验分享：如何才能做好 ChIP 实验？

ChIP（染色质免疫共沉淀，Chromatin Immunoprecipitation）技术是现代分子生物学研究，特别是表观遗传学的机制研究中一种非常重要的研究手段。ChIP 技术的主要目的是研究目的蛋白（包括： 修饰组蛋白， 转录因子， 辅因子及其他染色质蛋白）在染色质上的定位及丰度分析。

ChIP 技术可以帮我们解答特异性修饰组蛋白或转录因子在染色质上是如何分布的，通过分析它们的染色质定位可以为解码目的蛋白的功能提供帮助。以组蛋白修饰为例，组蛋白 H3 的第四位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）主要定位在转录活跃基因的启动子 CpG 岛上，这提示我们 H3K4me3 跟转录激活相关[1,2]；而组蛋白 H3K27me3 主要分布在转录抑制的基因上，这提示我们 H3K27me3 跟转录抑制相关[3,4]。再以转录因子为例，如果我们知道某种转录因子定位在哪些基因的启动子上，我们就可以知道，这个转录因子调控哪些基因表达。而丰度的多少可以提示这种转录因子对不同基因的调控强度。

ChIP 技术与蛋白复合物鉴定，体外酶活实验，基因敲低/敲除等实验相结合可以有效的帮我们解决很多表观遗传学的机制问题。

ChIP 实验原理

ChIP 技术的原理：1）通过甲醛将染色质上的 DNA 和目的蛋白交联，2）通过超声或酶解的方法将染色质片段化，3）包含有目的蛋白的染色质片段通过抗体富集纯化，4）通过加热解除 DNA 和目的蛋白的交联，5）通过蛋白酶和 RNA 酶消化去除目的染色质的蛋白和 RNA 之后，将目的 DNA 纯化出来。6）得到的 DNA 可以通过 PCR 检测目标区域的 DNA 是否被目的蛋白富集，或者通过 DNA 测序的方式检测目的蛋白在全基因组上的分布[5]。

ChIP 原理看似简单，但要想得到高质量的 ChIP 数据却非常具有挑战性。在每个关键步骤都有很多需要注意的细节。

下面是 Active Motif ChIP 实验专家根据多年经验总结的每个步骤中的原理及一些需要注意的细节。

第一步 染色质交联

为什么要用甲醛交联？

ChIP 技术主要是一种解码信息（目的蛋白在染色质上的分布）的方法。对于解码信息，首先就需要确保信息保存下来而不失真，ChIP 技术用到的最主要的信息保存方式是甲醛交联。甲醛交联也是 ChIP 实验非常关键的一个步骤。最早的 ChIP 技术是不用甲醛交联的[6]，只是后来发现甲醛交联能更好的保存蛋白与 DNA 的相互作用[7]，所以后来除了用于检测组蛋白修饰分布的 Native ChIP 以外[8]，其他的 ChIP 基本上都需要用甲醛交联。

甲醛作为交联剂有几个好处：

1）甲醛是一种非常活跃的小分子，它本身可以非常容易的穿过细胞膜及核膜进入细胞核，并通过醛基将 DNA 碱基上的氨基/亚氨基与蛋白的碱性氨基酸上的氨基/亚氨基交联[5]。2）甲醛的交联是可逆反应，可以通过加热的方式解除交联，从而方便后续的 DNA 分析[7]。

但是甲醛交联本身也有缺点：第一，甲醛交联本身需要一定的反应时间，对于小于 5s 的 DNA 与蛋白之间的动态相互作用是无法用甲醛交联捕获到的[9,10]；第二，甲醛本身的分子量很小，它的作用距离是 2 埃，所以如果蛋白和 DNA，或蛋白和蛋白之间的相互作用距离大于 2 埃，甲醛不能起作用[11,12]。第三，因为甲醛交联需要作用于氨基或亚氨基，如果目的蛋白与 DNA 作用区域没有碱性氨基酸，两者也不能被甲醛所交联[7]。另外，甲醛交联以后对蛋白本身的表位会有一定的影响，所以 ChIP 实验用到的抗体跟普通做 IP 的抗体也是有所不同的。这就需要 ChIP 实验使用 ChIP 级的抗体。抗体的问题将在后续做更详细的介绍。

甲醛交联有两点需要注意：

第一，甲醛交联用到的甲醛浓度和交联时间都是有严格要求的。根据多年来大家的摸索，一般的甲醛交联都选用 1% 的甲醛浓度，室温固定 10～15 分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与 DNA 的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致 ChIP 结果不理想。

第二，为了尽可能保存细胞原始状态下的目的蛋白在染色质上的定位，所以在甲醛交联之前，细胞需要尽可能少被人为处理。如果条件允许的话，直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有 1% 甲醛的 PBS 交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。甲醛交联反应结束之后，需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸（一般甘氨酸终浓度为 125 mM）与甲醛反应，终止交联反应。终止交联之后，样本需要经过 PBS 清洗（如果细胞数量比较少的话，可以在 PBS 里加入 0.1%～0.5% NP-40，这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上），细胞沉淀可以直接用液氮速冻，然后置于 -80 摄氏度长期保存。

组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞，但是大的组织块还是不太容易交联的很均一，所以大的组织块交联之前需要切成小块。但也并不是说组织块切的越小越好，组织块切的越小，细胞破坏的越严重。所以一般建议用两个刀片将组织块切成 1～3 mm3 大小。组织的交联时间一般可以延长到 15 min，这样能保证组织的充分交联。

另外，考虑到甲醛并不能很好的交联距离大于 2 埃的 DNA 和蛋白，还有一些文献报道用分子长度更长的交联剂（一般是双官能团的亚氨酸酯类）配合甲醛对蛋白和 DNA 进行交联。比如，DTBP，DMA，DSG，DSP，EGS[11-13]。

第二步 染色质片段化

染色质交联之后，需要通过超声或酶切的办法将染色质片段化。大部分实验室偏好于用前者，而很多做 ChIP 试剂盒的公司根据客户的需求（有些没有超声仪，有些把握不好超声条件），也大都推出了用广谱的核酸内切酶 MNase（Micrococcal Nuclease）酶切将染色质片段化的试剂盒。不管是用超声还是酶切，染色质片段化大小是 ChIP 实验的一个关键点。

以超声为例，打断后的 DNA 片段大小以 200～1 000 bp 为宜。DNA 片段太大，一方面影响 IP 效率，更重要的是会影响 ChIP 的分辨率。DNA 片段太小虽然理论上能得到更高的分辨率，但也会影响后续的 qPCR 和建库。另外，需要注意的是，超声是通过物理的作用力将 DNA 的共价键打断，从而实现染色质片段化。其在破碎 DNA 的同时，也会在一定程度上破坏目的蛋白以及目的蛋白和 DNA 之间的相互作用。所以，超声摸索应遵循适可而止的原则。

除超声仪外，样品制备本身有三个因素会对超声效果产生影响：1，超声用的 buffer。这其中尤其以 SDS 的影响最大，SDS 浓度越高，DNA 越容易被打断。同时盐离子和其他去垢剂浓度都会对超声产生一定影响，一般认为盐离子或去垢剂浓度越高，DNA 越容易被打断。2，细胞密度。超声时的细胞密度越高，DNA 越不容易被打断。所以建议细胞密度应小于 107/ml 裂解液。3，细胞类型。不同细胞类型间，超声效果差异也很大。相对于常用的肿瘤细胞系，很多原代培养的细胞以及组织细胞的染色质超声破碎会更困难些。

超声之后，一般需要先检测超声效果，确定 DNA 片段大小合适以后再做后续的 IP 实验。超声后的样品高速离心后，取部分上清，进行解交联。解交联是一个温度介导的共价键打开的化学反应[7]，温度越高解交联越快。通常的解交联条件是 65 ℃ 孵育 4 h- 过夜。有些实验室为了减少实验时间也会选择 95 ℃ 孵育 15 min。但是 95 ℃ 处理需要注意后续的缓慢退火过程，如果退火过快，DNA 就可能非正确复性，导致观察到的 DNA 大小产生偏差。解交联过程中可以加入适量的 NaCl，对 DNA 起到保护作用（据说是起保护作用，小编当年做 ChIP 时试过不加 NaCl 好像也没有太大影响）。解交联之后的染色质，加入适量的 RNase A，37 ℃ 处理 1 h 后，再加入适量的 Protease K 处理 1 h。消化处理之后的 DNA 可以经过抽提或 DNA 纯化柱回收。

第三步 IP 反应

超声之后的 IP 过程是 ChIP 成功与否的关键。这其中有两个因素是比较重要的：首先是抗体。ChIP 实验首先需要选用 ChIP 级的抗体。这个抗体需要满足几点要求：

识别目的蛋白的立体表位。这跟做 Western Blot 的抗体是有区别的，因为 WB 的抗体识别的是蛋白的变性表位。

识别甲醛交联后的立体表位。这跟做 IP 的抗体是有区别的。因为 ChIP 相对于 IP 需要甲醛交联的过程，甲醛会在 DNA 和蛋白质，以及蛋白和蛋白的氨基/亚氨基之间形成共价键，所以 ChIP 级的抗体还要识别甲醛交联后的目的蛋白。这跟免疫荧光的抗体有点类似。

ChIP 级的抗体跟目的蛋白有足够强的相互作用，能够耐受高盐，低盐及多种去垢剂（比如 0.1% SDS，1% Triton X-100 或 NP-40）的清洗。所以选择抗体时，最好选择文献报道可以用于 ChIP 实验的抗体，或抗体公司提供 ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 数据的抗体。

IP 的另外一个关键因素是 buffer，这包括 binding buffer（超声用 buffer）和 wash buffer。因为组蛋白与 DNA 的结合比较牢固，所以相对来说组蛋白修饰的 ChIP 更容易做，对 buffer 的要求也不是太严格。但是对于很多转录因子来说，因为本身跟 DNA 不是特别紧密（很多都是动态结合），在同一染色质区域，只有很少部分细胞可以捕获到目的蛋白和 DNA 的结合，所以通过合适的 buffer 将目的蛋白结合的 DNA 与背景 DNA 区分并分离出来就显得很关键了。一般来说，选用的 Buffer 越剧烈，背景 DNA 去除的就会越干净，但同样的，目的 DNA 也会被更多的清洗掉。反之，选用的 buffer 越温和，目的 DNA 得到的就会越多，但同样的，背景 DNA 也就残留的越多。对于去垢剂来说，离子型去垢剂（如 SDS，SDC）比非离子型去垢剂剧烈得多。对于盐来说，剧烈程度 LiCl ＞ NaCl ＞ KCl。去垢剂的选择，盐和去垢剂的浓度都会对 ChIP 效果产生很大影响。很多实验室或公司在这方面都有自己独到的 buffer 配方。

最后，除了以上关键的两个因素之外，为了降低背景，很多实验会在两个地方做优化：1，在超声破碎之前，首先破碎胞浆，通过离心将胞浆胞核分离，去除胞浆蛋白，降低胞浆蛋白干扰。2，用超声后的染色质与 protein A/G beads 预孵育，在去除 beads 之后再加入鲑精 DNA 预封闭过的 protein A/G beads 和目的蛋白抗体进行孵育。（根据个人的经验，这两点优化可能能降低背景，但是并不是 ChIP 成功与否的关键。当然对于与染色质结合不强的蛋白的 ChIP 或少量的细胞的 ChIP，降低背景就比较必要了）。

相关链接：如何判断 ChIP 实验是否成功？

Active Motif ChIP 实验相关产品：

ChIP 抗体

ChIP 试剂盒

磁珠/琼脂糖珠

其他

参考文献：

1. Santos-Rosa, H., et al., Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature, 2002. 419(6905): p. 407-11.

2. Bernstein, B.E., et al., Genomic maps and comparative analysis of histone modifications in human and mouse. Cell, 2005. 120(2): p. 169-81.

3. Bracken, A.P., et al., Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes Dev, 2006. 20(9): p. 1123-36.

4. Cao, R. and Y. Zhang, The functions of E(Z)/EZH2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3. Curr Opin Genet Dev, 2004. 14(2): p. 155-64.

5. Kuo, M.H. and C.D. Allis, In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods, 1999. 19(3): p. 425-33.

6. Hebbes, T.R., A.W. Thorne, and C. Crane-Robinson, A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO J, 1988. 7(5): p. 1395-402.

7. Solomon, M.J. and A. Varshavsky, Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82(19): p. 6470-4.

8. Wagschal, A., et al., Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) on Unfixed Chromatin from Cells and Tissues to Analyze Histone Modifications. CSH Protoc, 2007. 2007: p. pdb prot4767.

9. Schmiedeberg, L., et al., A temporal threshold for formaldehyde crosslinking and fixation. PLoS One, 2009. 4(2): p. e4636.

10. Kennedy-Darling, J. and L.M. Smith, Measuring the formaldehyde Protein-DNA cross-link reversal rate. Anal Chem, 2014. 86(12): p. 5678-81.

11. Zeng, P.Y., et al., In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques, 2006. 41(6): p. 694, 696, 698.

12. Fujita, N. and P.A. Wade, Use of bifunctional cross-linking reagents in mapping genomic distribution of chromatin remodeling complexes. Methods, 2004. 33(1): p. 81-5.

13. Zhang, L., et al., Successful co-immunoprecipitation of Oct4 and Nanog using cross-linking. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 361(3): p. 611-4.