生物粒子介导的 DNA 转染实验
材料与仪器CaCl2 乙醇 甘油 亚精胺 质粒DNA 细胞生长培养基基因枪 金或钨粒子 镜头纸 微量离心管 需转染的细胞或组织步骤材料缓冲液与溶液贮存液、缓冲液
材料与仪器
CaCl2 乙醇 甘油 亚精胺 质粒DNA 细胞生长培养基
基因枪 金或钨粒子 镜头纸 微量离心管 需转染的细胞或组织
基因枪 金或钨粒子 镜头纸 微量离心管 需转染的细胞或组织
步骤
材料
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录1。
稀释贮存液至所需浓度
CaCl2(2.5mol/L)
乙醇
未曾打开过的纯乙醇一瓶。乙醇有吸湿性，在空气中会吸收水分。在下述方法中. 第 1、2、3步用含水的乙醇洗涤会影响细胞与组织的有效转染。
甘油（50% 水溶液）
高压灭菌。
亚精胺（0.1mol/L)
用去离子水溶解适量亚精胺（无碱型)，用0.22um滤器过滤除菌。溶液等分为小份，-20°C保存。毎月制备新的贮存液。
核酸与寡核苷酸
质粒DNA
如果是第一次用基因枪转染一种新细胞系或组织，应使用编码适当标记基因的表达质粒来优化转染条件。例如表达E.coli.β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶（植物）或如新霉素抗性等选择性标记的载体。实验过程优化后可使用表达目的基因或cDNA的质粒。
在生物粒子转染过程中. 是否可以使用用各种含有不同量脂多糖的层析树脂纯化的质粒DNA, 研究者对此意见不一。显然. 即使有少量内毒素/脂多糖污染质粒DNA, 转染效率也会降低建议使用CsCl-溴化乙锭离心纯化质校DNA(见第1章方案10)。用H2O溶解纯化的质粒DNA至终浓度1ug/ul。
培养基
细胞生长培养基[完全培养基与（备选）选择性培养基]
特殊设备
基因枪
通常使用 Biolistic PDS-1000/He粒子转运系统，Bio-Rad 公可生产，包括分隔真空与氦线连接的轰击室。需要一个能够产生5英寸汞柱的泵通常，家用真空线不能用于此实验。固定于工作台或墙壁的高压(2400-2600psi)氦罐（纯度>9.999%) 与仅器连接。
金或钨粒子（微载体）
用于转染细胞的 DNA 通过直径 0.6um 至 5um 钨或金粒子转移到细胞中，对于特定的细胞或组织最佳粒子直径由经验确定。粒子从公司购买（如 Bio-Rad公司或 Sylvania 公司）按照下述第一步制备 DNA 包被。
镜头纸
微量离心管（1.5 ml)
使用质量好的离心管。有些品牌或批次的离心管会过量结合基因枪实验中用作弹头的胶状粒子。
附加试剂
本方案第 8 步可能需要第17 章方案 7 所列试剂。
细胞与组织
需转染的细胞或组织
各物种的貼壁培养细胞可在生长至 50%~80% 汇合度时轰击转染。悬浮生长的植物细胞用Buchner 滤器 Whatman1 号滤纸（直径 7 cm) 过滤，将收集的细胞置于浸有高渗培养基的无菌滤纸上（详情见 Sanford et al.1993)。
新解剖的哺乳动物组织切成约 400um 左右的片状，轰击前按照 McAllister 等（1995) 介绍的方法置于培养皿中。
培养的细菌与酵母根据其种属及株于中或晚对数期离心收集，重悬于少量高渗培养基中，轰击前平铺于滤纸上的薄层琼脂上（1x108~2x109 细胞)，滤纸置于 Petri 平皿中。
方法
1. 制备钨或金粒子
a. 称 60 mg 钨或金颗粒置于 1.5 ml 离心管中。
b. 在颗粒中加入 1 ml70% 乙醇，室温下持续振荡 5 min, 离心管于工作台上放置 15 min。
c. 高速离心 5s 收集粒子。
d. 轻轻弃去上清，用 1 ml 灭菌水重悬粒子，振荡 1 min。离心管于工作台上放置 1 min。
e. 髙速离心 5S 收集粒子。
f. 再用水洗涤 3 次以上（按步骤 d 与 e)。
g. 第 4 次洗涤后弃去上清，用 1 min50% 甘油重悬粒子。
洗涤后的粒子浓度应达到 60 mg/ml, 室温下可保存 1~2 周。长时间放置会氧化，从而降低转染效率。
2. 每 6 个平皿的细胞或组织，按下述方法制备一份 DNA 包被的粒子：
a. 在持续振荡粒子贮存液的情况下，吸取 50ul(约 3 mg)。
b. 转移至离心管中，边振荡边加入下列溶液：
质粒 DNA(约 2.5ug） 2.5ul
2.5mol/L-CaCl2 50ul
0.1mol/L 亚精胺 20ul
加入上述试剂后，再持续振荡 3 min。
此过程中持续振荡是非常必要的，可以保证 DNA 均匀包被粒子。
c. 离心管于工作台上放置 1 min 使粒子沉淀，高速离心 2s 收集粒子。
长时间离心会导致金属粒子聚集成块，降低转染效率。
d. 弃去上清，加 70% 乙醇 140ul 于粒子沉淀上。弃去 70% 乙醇，在不动粒子的情况加 100% 乙醇 140ul, 弃去上清，加入 50ul 乙醇。
e. 轻轻敲击离心管侧壁使粒子重新悬浮，轻轻振荡 2~3%
3. 生产商提供的固定装置将一个大载玻片固定于基因枪的金属支架上。用 6ul 乙醇洗涤玻片 2 次，每次洗完用镜头纸擦干。
4. 振荡第 2 步的沉淀 1 min, 振荡时，吸取 6ul 悬液（约 500ug 粒子）快速铺于载玻片中心 1 cm 范围的区域上。
5. 重复步骤 3 与 4, 直至所需载玻片上均铺好粒子。使含 DNA 包被粒子的乙醇悬液在载玻片上干燥。
6. 载玻片置于基因枪上，按照操作说明轰击细胞平皿或组织片。
7. 当气压恢复至大气压时，移开损伤的细胞或组织，将其置于适当的培养条件下。弃去断裂的载玻片，重复步骤 6 与 7, 直至所有平皿均受到轰击。
8. 如要获得稳定转化，直接进行第 9 步。如要瞬时表达，则于轰击 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli.β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照本章方案 1 的附加方案中介绍的组化染色方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
• 如果使用表达β-葡萄糖醛酸酶的质粒 DNA, 按照后面附加方案：单层细胞组化染色鉴定 P-葡萄糖醛酸酶中介绍的方法检测β-葡糖醛酸酶活性。
• 如果表达的是其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好（1）用每一构建体转染数个培养皿（2） 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3） 将细胞汇集起来；以及（4） 重铺细胞于数个培养皿上。
9. 分离稳定转染体：用完全培养基培养 48~72 h 后，将受轰击的细胞转移至选择性培养基。选择性试剂的浓度与培养条件根据细胞类型而定。
缓冲液与溶液
贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录1。
稀释贮存液至所需浓度
CaCl2(2.5mol/L)
乙醇
未曾打开过的纯乙醇一瓶。乙醇有吸湿性，在空气中会吸收水分。在下述方法中. 第 1、2、3步用含水的乙醇洗涤会影响细胞与组织的有效转染。
甘油（50% 水溶液）
高压灭菌。
亚精胺（0.1mol/L)
用去离子水溶解适量亚精胺（无碱型)，用0.22um滤器过滤除菌。溶液等分为小份，-20°C保存。毎月制备新的贮存液。
核酸与寡核苷酸
质粒DNA
如果是第一次用基因枪转染一种新细胞系或组织，应使用编码适当标记基因的表达质粒来优化转染条件。例如表达E.coli.β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白、β-葡萄糖醛酸酶（植物）或如新霉素抗性等选择性标记的载体。实验过程优化后可使用表达目的基因或cDNA的质粒。
在生物粒子转染过程中. 是否可以使用用各种含有不同量脂多糖的层析树脂纯化的质粒DNA, 研究者对此意见不一。显然. 即使有少量内毒素/脂多糖污染质粒DNA, 转染效率也会降低建议使用CsCl-溴化乙锭离心纯化质校DNA(见第1章方案10)。用H2O溶解纯化的质粒DNA至终浓度1ug/ul。
培养基
细胞生长培养基[完全培养基与（备选）选择性培养基]
特殊设备
基因枪
通常使用 Biolistic PDS-1000/He粒子转运系统，Bio-Rad 公可生产，包括分隔真空与氦线连接的轰击室。需要一个能够产生5英寸汞柱的泵通常，家用真空线不能用于此实验。固定于工作台或墙壁的高压(2400-2600psi)氦罐（纯度>9.999%) 与仅器连接。
金或钨粒子（微载体）
用于转染细胞的 DNA 通过直径 0.6um 至 5um 钨或金粒子转移到细胞中，对于特定的细胞或组织最佳粒子直径由经验确定。粒子从公司购买（如 Bio-Rad公司或 Sylvania 公司）按照下述第一步制备 DNA 包被。
镜头纸
微量离心管（1.5 ml)
使用质量好的离心管。有些品牌或批次的离心管会过量结合基因枪实验中用作弹头的胶状粒子。
附加试剂
本方案第 8 步可能需要第17 章方案 7 所列试剂。
细胞与组织
需转染的细胞或组织
各物种的貼壁培养细胞可在生长至 50%~80% 汇合度时轰击转染。悬浮生长的植物细胞用Buchner 滤器 Whatman1 号滤纸（直径 7 cm) 过滤，将收集的细胞置于浸有高渗培养基的无菌滤纸上（详情见 Sanford et al.1993)。
新解剖的哺乳动物组织切成约 400um 左右的片状，轰击前按照 McAllister 等（1995) 介绍的方法置于培养皿中。
培养的细菌与酵母根据其种属及株于中或晚对数期离心收集，重悬于少量高渗培养基中，轰击前平铺于滤纸上的薄层琼脂上（1x108~2x109 细胞)，滤纸置于 Petri 平皿中。
方法
1. 制备钨或金粒子
a. 称 60 mg 钨或金颗粒置于 1.5 ml 离心管中。
b. 在颗粒中加入 1 ml70% 乙醇，室温下持续振荡 5 min, 离心管于工作台上放置 15 min。
c. 高速离心 5s 收集粒子。
d. 轻轻弃去上清，用 1 ml 灭菌水重悬粒子，振荡 1 min。离心管于工作台上放置 1 min。
e. 髙速离心 5S 收集粒子。
f. 再用水洗涤 3 次以上（按步骤 d 与 e)。
g. 第 4 次洗涤后弃去上清，用 1 min50% 甘油重悬粒子。
洗涤后的粒子浓度应达到 60 mg/ml, 室温下可保存 1~2 周。长时间放置会氧化，从而降低转染效率。
2. 每 6 个平皿的细胞或组织，按下述方法制备一份 DNA 包被的粒子：
a. 在持续振荡粒子贮存液的情况下，吸取 50ul(约 3 mg)。
b. 转移至离心管中，边振荡边加入下列溶液：
质粒 DNA(约 2.5ug） 2.5ul
2.5mol/L-CaCl2 50ul
0.1mol/L 亚精胺 20ul
加入上述试剂后，再持续振荡 3 min。
此过程中持续振荡是非常必要的，可以保证 DNA 均匀包被粒子。
c. 离心管于工作台上放置 1 min 使粒子沉淀，高速离心 2s 收集粒子。
长时间离心会导致金属粒子聚集成块，降低转染效率。
d. 弃去上清，加 70% 乙醇 140ul 于粒子沉淀上。弃去 70% 乙醇，在不动粒子的情况加 100% 乙醇 140ul, 弃去上清，加入 50ul 乙醇。
e. 轻轻敲击离心管侧壁使粒子重新悬浮，轻轻振荡 2~3%
3. 生产商提供的固定装置将一个大载玻片固定于基因枪的金属支架上。用 6ul 乙醇洗涤玻片 2 次，每次洗完用镜头纸擦干。
4. 振荡第 2 步的沉淀 1 min, 振荡时，吸取 6ul 悬液（约 500ug 粒子）快速铺于载玻片中心 1 cm 范围的区域上。
5. 重复步骤 3 与 4, 直至所需载玻片上均铺好粒子。使含 DNA 包被粒子的乙醇悬液在载玻片上干燥。
6. 载玻片置于基因枪上，按照操作说明轰击细胞平皿或组织片。
7. 当气压恢复至大气压时，移开损伤的细胞或组织，将其置于适当的培养条件下。弃去断裂的载玻片，重复步骤 6 与 7, 直至所有平皿均受到轰击。
8. 如要获得稳定转化，直接进行第 9 步。如要瞬时表达，则于轰击 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞：
• 如果使用的是表达 E.coli.β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照本章方案 1 的附加方案中介绍的组化染色方法操作。
• 如果使用绿色荧光蛋白表达载体，在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
• 如果使用表达β-葡萄糖醛酸酶的质粒 DNA, 按照后面附加方案：单层细胞组化染色鉴定 P-葡萄糖醛酸酶中介绍的方法检测β-葡糖醛酸酶活性。
• 如果表达的是其他基因产物，则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
为减小不同培养皿之间转染效率的差异，最好（1）用每一构建体转染数个培养皿（2） 孵育 24 h 后用胰酶消化细胞；（3） 将细胞汇集起来；以及（4） 重铺细胞于数个培养皿上。
9. 分离稳定转染体：用完全培养基培养 48~72 h 后，将受轰击的细胞转移至选择性培养基。选择性试剂的浓度与培养条件根据细胞类型而定。
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