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DNA实验

Southern印迹

2024-09-29 DNA实验 加入收藏
【原理】  Southern 印迹是将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。  DNA 分子经限制性核酸内切酶酶切,经琼脂糖凝胶电泳将得 DN

【原理】

  Southern 印迹是将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。

  DNA 分子经限制性核酸内切酶酶切,经琼脂糖凝胶电泳将得 DNA 片段按分子量大小分离,然后将含 DNA 片段的琼脂糖凝胶变性,并将单链 DNA 片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上,而各 DNA 片段的相对位置保持不变,这种滤膜可用于杂交反应。利用 Southern 印迹法可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析 (RFLP)等。

  【操作】

  (1)取一定量的待测 DNA 样品,用适当的限制性内切酶酶切。DNA 的量根据样品的种类及目的的不同而异,对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析,取 0.1 ~ 0.5 μ g 即可;而对于鉴定基因组 DNA 中的单拷贝基因顺序,则需要 10 ~ 20μg ;当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时,则需要多至 30 ~ 50 μ g 。酶切完毕,在琼脂糖凝胶中电泳,在其中 1 孔中加入适当的 DNA 分子量标准参照物。电泳结束后,溴化乙锭 (EB)染色,长波紫外线下观察电泳结果,用 1 张保鲜膜覆盖在凝胶上,复制下各分子量参照物及各 DNA 样品带的位置,在凝胶旁置 1 标尺照像。

  (2)切除无用的凝胶部分。将凝胶的左下角切除,以便于定位,然后将凝胶置于一搪瓷盒中。

  (3)将凝胶浸泡于适量的变性液中,室温下放 1 小时使之变性,不间断地轻轻摇动,对于较大的 DNA 片段 (如大于 15kb),可在变性前用 0.2mol / L HCl 预处理 10 分钟使其脱嘌呤后,再进行碱变性处理。

  (4)将凝胶用去离子水漂洗 1 次,然后浸泡于适量的中和液中 30 分钟,不间断地轻轻摇动。换新鲜中和液,继续浸泡 15 分钟。

  (5)如图 8-1 所示,在一塑料或玻璃平台上铺一层 Whatman 3mm 滤纸,此平台要求比凝胶稍大。将此平台置于一搪瓷盒或玻璃缸中,搪瓷盒中盛满 10 × SSC 。滤纸的两端要完全浸没在溶液中,将滤纸用 20 × SSC 湿润,用一玻璃棒将滤纸推平,并排除滤纸与玻璃板之间的气泡。

  (6)裁剪一块与凝胶大小相同或稍大的硝酸纤维素膜。注意操作时要戴手套,千万不可用手触摸,否则油腻的膜将不能湿润,也不能结合 DNA 。

  (7)将硝酸纤维素滤膜漂浮在去离子水中,使其从底部开始向上完全湿润。然后置于 20 × SSC 中至少 5 分钟。注意滤膜如果不能被湿润则不能用。

  (8)将浸泡好的凝胶上下颠倒后,置于上述铺了一层 Whatman 3mm 滤纸的平台中央。注意两者之间不要有气泡。

  (9)在凝胶的四周用 Parafilm 蜡膜封严,以防止在转移过程中产生短路 (转移液直接从容器中流向吸水纸而不是经过凝胶 ),从而使转移率降低。

  (10)将湿润的硝酸纤维膜小心覆盖在凝胶上,膜的一端与凝胶的加样孔对齐。排除两者之间的气泡。相应地将膜的左下角剪去。注意膜一经与凝胶接触即不可再移动,因为从接触的一刻起,DNA 已开始转移。

  (11)将两张预先用 2 × SSC 湿润过的与硝酸纤维素膜在大小相同的 Whatman 3mm 滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上,排除气泡。

  (12)裁剪一些与硝酸纤维素膜大小相同或稍小的吸水纸,约 5 ~ 8cm 厚。将之置于 Whatman 3mm 滤纸之上。在吸水纸之上置一玻璃板,其上压一重约 500g 的物品。

  (13)静置 8 ~ 24 小时使其充分转移,其间换吸水纸 1~2 次。

  (14)弃去吸水纸和滤纸,将凝胶和硝酸纤维素膜置于 1 张干燥的滤纸上。用软铅笔或圆珠笔标明加样孔的位置。

  (15)凝胶用溴化乙锭染色后紫外线下检查转移的效率。硝酸纤维素膜浸泡在 6 × SSC 溶液中 5 分钟,以去除琼脂糖碎块。

  (16)硝酸纤维素膜用滤纸吸干。然后置于两层干燥的滤纸中,真空下 80 ℃烘烤 2 小时,此过程使 DNA 固定于硝酸纤维素膜上。

  (17)此硝酸纤维膜即可用于下一步的杂交反应。如果不马上使用,可用铝箔包好,室温下置干燥处保存备用。

  (18)如用于杂交,杂交方法见实验三十二。

  【器材】

  琼脂糖电泳装置:真空泵;真空烤箱;其它实验室常规仪器及试剂。

  【试剂】

  适当的限制性核酸内切酶

  琼脂糖

  变性液: 1.5mol/LNaCl ; 0.5mol / L NaOH 。

  中和液: lmol / L Tris-Cl (pH8.0 ); 1.5mol / L NaCl 。

  转移液(20 × SSC ): 3mol / L NaCl ; 0.3mol / L 柠檬酸钠,pH7.0 。

  硝酸纤维素膜或尼龙膜


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