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DNA实验

DNA条形码的收集—分析方案实验

DNA条形码
2024-05-20 DNA实验 加入收藏
材料与仪器步骤材料 方法标本和组织处理大多数标本的条形码分析是直截了当的，但高度依赖于 D N A 的初始条件。因此,必须小心确保样本是在不损伤 D N A


材料与仪器

步骤

材料

 



2 . 1 标本和组织处理 1. 96 孔形式的 2-D 条形码保存管（ TrakMates， Matrix Technologies)。 2. 99. 9 % 乙 醇 （ 商业化酒精)。保存于可燃液体药品橱中。 3•慑子和（ 或）解 剖 刀 （FineScience Tools)。 2 . 1 . 1 基 因 组 DNA 提 取 ,/纯 化 —新 鲜 或 冰 冻 的 组 织 I. Dry Release 提取缓冲液： 5〜6 g Chelex-100(Bio-Rad Laboratories， Hercules， C A )， 10 m L 1 % 叠 氮 钠 （ Sigma-Aldrich， St.Louis， M 〇 ） ， I m L Tris-H C l ， p H 8. 3 , 超 纯 H 2O 定容至100 m L 。 I O m L 分装保存于4°t 。 2， 20 m g ，m L 蛋白酶 K(proteinase K , Invitrogen， Carlsbad， C A ): 100 m g 蛋白 酶 K ， 5 m L 超 纯 H 2〇。 0.1〜I m L 分装，保存于一20°C 。 3. DryRelease 工作液： I O p L 蛋白酶 K ， IOOpLDryRelease 提取缓冲液。 4•微量培养板（ Eppendorf， N e w Y o r k ， N Y )。 5. 封 盖 胶 条 （ A B g e n e， Rochester, N Y )。 6. P C R 仪 （Mastercycler E P Gradient， Eppendorf)。 2 . 1 . 2 基 因 组 DNA 提 取 / 纯 化 —档 案 标 本 1. NucleoSpin 96 组织试剂盒（ Macherey-Nagel)0 2. 99. 9 % 乙 醇 （ 商业化酒精） 。保存于可燃液体药品橱中。 3•微量培养板（ Eppendorf)。 4•封盖胶条（ ABgene)。
5. MatrixImpact n P1250 移 液 器 （ Matrix Technologies)。 6. 有深孔板转子的离心机（ 25R， Beckman Coulter)。 7• 培 养 箱 （ Fisher Scientific)。 2 . 2 条形码区域的PCR扩增 1. 1 0 % 海藻糖： 5 g E K + )-海藻糖脱水粉末（ Sigma-AWrich) , 超 纯 H 2O 定容至 5 0 m L 。 1〜2 111乙分装保存于一20°〇。 2. I O X P C R 缓 冲 液 （N e w England Biolabs)。保存于一2CTC。 3. 50 m m o l / L M g C l 2: 2 m L lmol/L M g C l 2(Sigma-Aldrich)， 38 m L 超纯 H 2O I m L 分装保存于一20°C 。 4. 10 m m o l / L d N T P 混 合 物 （N e w England Biolabs)。 100 fzL分装保存于一2〇° C 。 5_ 100 ymol/L 引物储液：按制造商说明将干燥的引物（ Invitrogen) 溶解到超纯 H 2O 中，配置终浓度为lOOpmol/L 。保存于一20°C 。 6 . 1 0 11〇 11〇 1/1引物工作液： 2 0 1 ^ 1 0 0 / ^〇 1/乙引物储液， 1 8 〇 4 超 纯 1 ^ 0 。保存 于一20°C 。 7. Tag 聚 合 酶 （N e w England Biolabs)。 50 fiL每份分装保存于一20°C 。 8. 微量培养板（ Eppendorf)。 9. 封 盖 胶 条 （ ABgene)。 10. P C R 仪 （Mastercycler E P Gradient， Eppendorf)。 2.3 PCR产物检测 1. Mother E -base(Invitrogen)0 2. 2 % E -gel% 凝 胶 （ Invitrogen)。开封前可保存于室温，启封后存于4°C 。琼脂 糖包装于玻璃内，但因含有溴化乙锭，废液应按地方法规处置。 3. 凝胶成像 系 统 （AlphaImager 3400， AlphaInnotechCorp.)。 2 . 4 测序 1. BigDye V3.1•循环测序试剂盒（Applied Biosystems)。保存于一20°C 。 2. 5X 测序缓冲液 （Applied Biosystems)。保存于 4°C 。 3. 1 0 % 海藻糖： 5 g E K + )-海藻糖脱水粉末（ Sigma-Aldrich)，超 纯 H 2O 定容至 5 0 m L 。 1〜2m L 分装保存于一2(T C 。 4. 100p n 〇l/L 引物储液：按制造商说明将干燥的引物（ Invitrogen) 溶解到超纯 H 2O 中，配置终浓度为100 jumol ' L 。保存于一20°C 。 5 . 1 0 / ^ 1 〇 1 /1 引 物 工 作 液 ： 2 0 | ^ 1 0 0 /^ 1 1 1 〇 1 / 1 引 物 母 液 ， 1 8 0 /^ 超 纯 氏 0 。 保 存 于一20°C 。 6. 微量培养板 （ Eppendorf)。 7 . 封 盖 胶 条 （ A B g e n e )。 8. P C R 仪 （Mastercycler E P Gradient, Eppendorf)。
2 . 5 测序反应纯化 1.葡聚糖凝胶0 5 0 (Sigma-Aldrich)。皮肤接触或吸人有害，处理时推荐戴口罩 和手套。 2_ AcroPrep 96 0. 45 pmol/L G H P 过 滤 板 （Pall Corp)。 3•甲酰胺（ Applied Biosystems)。保存于一20°C 。试剂有 毒，尽量将暴露降到最 小 ，废品处置应遵循地方法规。 4. 装 柱 器 （ Millipore)。 5. 离心连接框（ Millip0re)。 6. % 孔 反 应 板 （Applied Biosystems)。 2 . 6 序列分析 1. 96 孔 隔 板 （Applied Biosystems)。 2. 96 孔 板 基 底 （Applied Biosystems)。 3. 96 孔板固定器 （Applied Biosystems)。 4•含 EDTA 的 3730 缓 冲 液 （10X )(Applied Biosystems)。保存于 4°C 。 5. POP-7聚 合 体 （ Applied Biosystems)。室温可保持稳定7〜1〇天。此试剂有毒； 应尽量减小暴露，并按地方法规处置废品。 6. 48 毛 细 管 （50 c m ) 阵 列 （Applied Biosystems)。 7. 3730 D N A 分析毛细管测序仪（Applied Biosystems)。 2 . 7 序列编辑/排列 1.序列编辑软件： Sequencher(Gene Codes, A m m A r b o r ， M I )， SeqScape(A p ­ plied Biosystems) 或 Lasergene(D N A S T A R , Madison, W I )
 

 

方法

标本和组织处理
大多数标本的条形码分析是直截了当的，但高度依赖于 D N A 的初始条件。因此,必须小心确保样本是在不损伤 D N A 的方式下处死的，收集后尽快进行分析（ 见注释1 ) , 且应采取预防措施来防止被其他种类 D N A 污 染（见注释 2)。有六个关键步骤来确保每一个标本的正确处理和编档。

1.将标本安排为 9 4 个 一 批（ 见注释 3)。 为 9 4 个标本中的每一份激光打印一个标有单独登记号的小标签。如果一个凭证标本需要保存，在其上或其容器上贴一个标有其登记号的标签。

2.用乙醇或清洁剂清洁工作表面，除去 DNA 和 DNA 酶污染。

3.对每个标本，用酸或火焰除菌的镊子和（ 或）手术刀取下一小块组织样本。将样本放人 TrakMates 盒里一个独立的保存管中，并贴好相应的标本登记标签。

4.室温保存时，将管中充满乙醇。对于干燥的组织（例如昆虫腿）或要冰冻保存的组织，可不必额外加乙醇。

5.在电子表格程序上记录标本登记号及相关数据（关于表格程序和归档，见w w w .barcodeoflife.org)。

6.给每个标本拍照。

基因组 DNA 提取/纯化

基因组 DNA 的提取和（ 或）纯化有很多可供选择的方法（见注释 4)。其中很多方法在高通量动物 DNA 条形码中的效率已经过了全面的检测（2 4 ) ; 两个针对新鲜/冰冻组织或存档组织的非常有效的操作方法在下面内容中分别加以说明
3_ 2. 1 新鲜或冰冻的组织基因组D N A 的提取/纯化 基于 Chelex的 DryRelease方 法 （2 4 ) ( 见注释5) 是一种快速及经济的D N A 分离 方法，对于新鲜及冰冻的组织尤其适用。 1•用多通道移液器，宽口吸头分装3〇 〜110 ^LDryRelease工 作 液 （ 见注 释 6 ) 到 微量培养板的每孔中。分装前和分装时不断混匀以确保每孔间树脂分散均匀。 把每一排用封盖胶条盖住。 2. 将少量的组织（ 例 如 1〜2 m m 的昆虫腿或1〜2 m m 3的乙醇保存的组织）放入 板中的每一孔。为了避免交叉污染，每一次只对一排孔操作。盖上盖子，避免 晃动以确保组织碎片保持在溶液中。 3. 55°C 孵育 12〜24h 。 4. IOOOg•离心5m i n，在 P C R 仪 中 95°C孵育样本20min使蛋白酶K 变性。 5•将提取物保存于一20°C 。 6•开始P C R 前 ， 1000名离心5m i n。 7•用1〜2 D N A 样品做P C R 。确 保 Chelex树脂不被转移到P C R 反应中。 3. 2 . 2 档案标本 基 因 组 D N A 的提取/纯化 NucleoSpin 96 组 织 试 剂 盒 （ Machery-Nagel) 是一种基于二氧化硅膜的方法，对于新鲜和档案 (5年以上)(见注释7 ) 组织都适用。洗脱的 D N A 是高度纯化的，使其成为分离长期保存标本D N A 的理想方法。 1 . 将 少 量 组 织 （ 例 如 2 〜4 m m 的昆虫腿或 1〜3m m 3的乙醇保存的组织） （ 见 图 1 ) 加 到试剂盒提供的圆孔模块的每孔中。是否 浸软组织可自由选择，但把组织分割成小 块有助于提高最终的D N A 产率。 2. 制备裂解工作液，将 18 m L 缓 冲 液 T l 与 头大小对比。 （ A) 蛾的腿， （ B) 小甲壳 2. 5 m L 蛋白酶K 混合，用多通道移液器，虫 （ Da^ „ ia) ， （ c ) 鸟的羽毛和① ) 转 移 200 ( LiL 工作液到圆孔模块的每孔中肌肉组织（ 复制自参考文献24)。
(见注释8)。 3. 用提供的封盖胶条封闭孔，剧烈摇动io〜15 s 混勻。 1500 g•离心15 s，使样品 收集在孔底部。 4. 56°C 孵育至少6h (最好8〜24h) 以消化。盖上封盖胶条防止爆出。 5 . 消化后， 1500 g 离 心 I5 s 从封盖胶条上去除冷凝物。 6. 预混合乙醇和缓冲液B Q l :混 合 20 m L 乙醇和20 m L 缓冲液B Q l 。用多通道移 液器，转移400斗混合液到圆孔模块的每孔中。用封盖胶条封闭孔。剧烈摇晃 10〜15 s 并 1500 g 离 心 10 s 以从封盖胶条上去除样品。 7. 揭开封盖胶条，从圆孔模块的孔中转移裂解产物（ 大 约 600 ^l ) 到组织接合板 的孔中，并将板放在方孔模块上。用试剂盒提供的自黏性P E 箔密封板。 8. 5600 g•离心IOmin将 D N A 结合在二氧化硅膜上。 9. 进行第一步漂洗：使用多通道移液器加500 p L 缓冲液B W 到组织结合板的每孔 上。用一片新的自黏性P E 箔密封板并5600 g 离 心 2m in。 10•为了调节流出容量，将现在的方孔模块换为一个新的方孔模块，将其放在组织 结合板下面。 11.第二步清洗：用多通道移液器在组织结合板的每孔加70〇 B 5 缓冲液，用一 片新的自黏性P E 锡箔纸封板，然 后 5600 g 离心4min。 12•移去自黏性P E 箔，将组织结合板放在无菌的微孔板上， 7〇 ° c 孵 育 1〇 min以蒸 发残留的乙醇。 13. 在组织结合板的每孔膜上直接加入30〜 1〇〇 ^L d d H 2O (见注释9)，室温孵育 I m i n并封板。 14. 将组织结合板和微孔板置于敞开的M N 离心管条支架上（ 见注释1〇)， 5600 g 离 心 2m i n，将结合板/微孔板/支架翻转18〇。，再次离心，小心移去组织结合 板和支架，密封微孔板。 15. 短暂存放置于4°C ，长时间储存置于-2(T C ， P C R 扩 增 时 用 1〜2 juL D N A 样本。 3 . 3 条 形 码 区 的 PCR扩增 条形码标记选择的一部分原因是因为其易于分离、拷贝数高、保守的侧翼区便于设 计引物等。因此，使用合适的样本和引物就可以对这些区域进行常规的P C R 扩增。对 于特另! J的情况，只需要耙向更小的目的片段或者对引物序列做小的改动即可 1. 解冻试剂并放置于冷板上。 2. 按 表 1 配方在1.5m L 离心管中混合试剂。添 加 剂 （ 见 注 释 1 5 ) 或者其他的酶 (见注释1 6 ) 可能增加P C R 的成功率、产量和准确性。表 2 给出了用于扩增不 同分类群C O I 条形码区的一系列引物。 3. 轻轻振荡混合，每孔微孔板分装10.5 juL P C R 混合物。为节省时间，将总混 合 物 分 成 8 份 （ 约 138M L ) 加 到 8 孔 P C R 管条，用多通道移液器分装至微 孔板表 I 条 形 码 区 P C R 扩 增 的 主 混 合 物 配 方 （ pL)表 2 不 同 分 类 群 COI的 P C R 扩 增 所 用 引 物
4. 用多通道移液器在每孔中加0. 5〜2 D N A 提 取 物 （ 见注释I7 和 19)。 5. 密封微孔板。 6. 1000 g•离心 10 s。 7. 放人热循环仪（ 见注释1 9 ) 并选择程序（ 见注释2 0 ) ; 图 2 是一个程序举例undefined4 PCR产物检测 对于符合要求的样本的检测，可直接从条形码P C R 进人到测序反应。然而，对于 比较古老的样本或者一个新的分类群样本，通常需要对P C R 反应进行筛选以发现成功 的扩增产物。这项工作以前是比较费时费力的，其中包括凝胶灌注和每个反应产物的上 样。然而，无缓冲液预制琼脂糖凝胶的引入就解决了这一系列问题。 1 . 将 1 \ 4 〇 1 ；1 ^ 瓦 七 3 3 6 接 入 电 源 。 按 下 “口 ' ^ / ^ § ’’ （9 〇 评 6 1 ' / 口 1 ^ 以 1 1 1 ) 按 钮 ， 选 择 E G 程序。按 下 “time”按钮设置时间（ 见注释22)。 2•从包装中取出凝胶，并拔出梳子。将 凝 胶 滑 人 Mother E -B a s e 的两个电极连 接处。 3.用多通道移液器加16 d d H 20 。 4•必要时加适量的D N A 分子质量标准。 5. 用多通道移液器加4 fJL样品。 6. 按 一 下 “p w g /prg”按钮开始电泳，此时红灯变成绿灯。 7•电泳结束时（ 此时红灯闪烁，并伴随蜂鸣声） ，按 下 “p w g /prg”按钮。 8.拿出凝胶，并用凝胶拍摄系统拍摄凝胶的数字图像。 9■可以用 Invitrogen E-Editor 软 件 （ 从 w w w .invitrogen.com/egels 下载）排列泳 道和处理图像。 10.将 E -gel图片拷 到 “电子实验记录本”电子表格中用于选择（ 见注释2 3 ) ( 见 W W W .barcodeoflife.org的实验室电子表格和文献） 。 11•凝胶保存于4°至少可以重复利用一次。 3 . 5 测序 为了降低成本（ 见注释25)， P C R 产物直接用于测序反应（ 见注释24)，并可以提 前混合反应物冷冻储存，这样方便且利于保证质量控制（ 见注释26)。 • 218 .
1. 解冻试剂并放置于冷板上。 2. 在 1.5 m L 离心管中混合表3 中的各种试剂（ 见注释27)。每个样本准备正向和 反向的测序反应混合物3. 轻轻涡旋混匀，微孔板每孔加入9 ^ x L 测序反应混合物。将总混合物分成8 份 (约 117^L ) 加 到 8 孔 P C R 管条，用多通道移液器分装至微孔板。 4 . 用多通道移液器在每孔加0. 2〜5 /xL P C R 产 物 （ 见注释28)。 5. 密封微孔板。 6. 1000 g■离心 10 s。 7. 放入热循环仪并选择程序（ 见注释2 9 ) ; 图 3 是一个程序举例。3 . 6 测序反应纯化 相比传统的和更新的纯化方法，葡聚糖凝胶柱纯化法是快速、可靠和性价比高的方 法 （ 见注释30)。 1•用柱上样器将滤板的每孔填入葡聚糖凝胶。 2•用300 超纯水润湿每孔。 3. 使用前，在冰箱中过夜或者室温放置3〜4h , 让葡聚糖凝胶充分吸涨。 4. 通过离心固定装置将葡聚糖凝胶滤板和一块空的微孔板叠在一起，可用橡胶带 加固。 75Og■离心3m i n，去除多余的水分。 • 21。

5.用多通道移液器在每孔的葡聚糖凝胶中央加人测序反应物（约 10 u L )。

6.用多通道移液器和一个 8 孔 P C R 管条，在 无 菌 的 9 6 孔反应板的每孔中加入

1 0 / xL 甲酰胺。

7.洗脱纯化的测序反应物到甲酰胺中，将反应板放到葡聚糖凝胶滤板下方，用橡胶带固定， 750 g 离 心 3m i n。

3.7 测序分析

D N A 条形码设备要求高通量测序。 Applied Biosystem 和 A m e r s h a m 公司拥有几种可靠的且具备不同测序能力的设备。以下方案采用的是 Applied Biosystem 3730 毛细管测序仪。

1.在反应板上盖上胶垫。

2.将反应板放人基座，装上定位器。

3.在装配好的板上，打印并粘贴一个条形码。

4.装配好的板放人 3730 仪器中。

5.需要时进行常规的 3730 检修。

6.使用数据收集系统的板管理器，输入板号。

7.在运行调度程序中开始运行。

3.8 测序编辑/比对

分析高通量条形码的序列编辑和比对软件包的基本功能包括收集双向数据和编辑跟踪文件。 Sequencher、 SeqScape 和 Lasergene 等软件都具有这样的功能，也具备其他功能。

1.使用选用的程序或软件，打开测序完成后的跟踪文件。如果选择的软件功能强大的话，所用样本可以一次分析完成。

2.收集每个样本的正向和反向读取的数据。

3.去除每组数据中的引物序列。

4.仔细校对每个碱基名称，对于错误命名或者未命名的碱基做适当的调整。

5.用 Fasta 格式保存序列，上传至合适的项目或者其他在线序列库。

注释

1. 不损伤 D N A 的处理方法指的是冷冻、氰化物处理或者乙醇浸泡，尽量避免用乙酸乙酯或者福尔马林这些可损伤 D N A 的方法处理。 D N A 在脱水的样本中通常可以保存至少一年，之后会慢慢发生降解。冷 冻 样 本（特别是保存在低温状态）的 D N A 会保持长时间的稳定。但是在乙醇保存的样本中的 D N A 会因为酸化作用常发生降解。因此，条形码分析最好在样本收集好之后立即进行。

2.所用样本应该在干净的表面操作，所用组织处理仪器在处理每个样本之后都要用酸或火焰灭菌。过程中留两个空白孔用于阳性对照和阴性对照，其 余 94 孔用于样品，小心避免加样时孔间的交叉污染。

3 . 在任何想要高产率的实验室，所有条形码的分析步骤须在 96 孔板中进行。操作

4. 除了这里讨论的基于 chelex 和膜的方法之外，还有许多其他可供选择的试剂盒用于 D N A 的分离和释放。磁珠的运用越来越普遍，主要因为其操作便于自动化。在时间紧急的情况下，有几种试剂盒可保证在几分钟之内完成 D N A 抽提，例如 Extract-N - A m p P C R Kit(Sigma-Aldrich) 和 F T A cards (Waterman-Florham Park， N J )。这些方法现正被评估用于高通量 D N A 条形码方法的可行性。

5.D r y R ekase 是基于 chelex 的分离 D N A 的方法，可迅速释放 D N A 于溶液中，以进行下游的应用操作 （24)。它只需要极少的组织样本并缩短操作时间，但不适于含有高水平 P C R 抑制剂的样本（如血红蛋白）和 D N A 已降解的样本，以及需长期保存的纯化 D N A 。

6.反应体积取决于样本的体积，可 从 30〜100 ^L 。例如，小型甲壳类动物或小型昆虫的腿等器官组织只需要 30 juL 抽提液。而脊椎动物的小块组织则可用 100〜110 u L 裂解提取液。

7.Nucleospin 96 Tissue 试剂盒是基于膜的 D N A 抽提方法，取决于高盐浓度下D N A 与二氧化硅膜的亲和力。这种方法非常敏感并可获得高纯度的 D N A ，可用于研究有降解的 D N A 样品。高昂的成本和需花费大量的时间限制了它的应用。

8.使用该方法和其他的大部分试剂盒一样，需用手动或电动的多道移液器来高效地进行 96 孔板上 D N A 的抽提操作。类似的，几乎所有的用于 96 孔板的试剂盒和操作步骤均可以用自动分液装置工作站进行。

9.在用 DryRelease 方法时，少 量 标 本（或 D N A 有可能降解的样本）用少量蒸馏水洗脱即可，而当用新鲜或大块样本时需用大量水洗脱。

10.离 心 ％ 孔板时需放在正方形离心模块上，或者放置于开放的 M N 试管离心架上以免离心力的作用使其碎裂。

11. 引物设计至关重要，微小的改变将会对条形码的合成产生极大的影响。研究一个新的种群所要做的第一步是鉴别出一个最优化的引物。为了解决引物和模板D N A 之间的错配，建议使用简并引物或含次黄嘌呤的引物 （26)。通过含有2〜4 个简并碱基或次黄嘌呤碱基引物的运用，可从复杂的模板中得到较好的条形码扩增，并且防止核内假基因的扩（27）。

12. 所有的 P C R 试剂的相关操作推荐使用灭菌的含塞子的吸头以避免不必要的污染 。在开始实验操作前用酒精或去垢剂清洁操作台面。在建立反应前， D N A模 板（D N A 抽提物或 P C R 产物）应远 离 P C R 试剂。所有试剂取用完毕并重新放回冰箱后，再加人 D N A 模板。

13.添加海藻糖是可选的，但加人海藻糖后可能会增加 P C R 反应成功的机会 （28)(图 4)，并可促进冻结分装好的主混合液。该混合液可把存于—20- C i〜3 个月

或直接分装于 96 孔板于一 20°C 保 存 1 个月。

14.为节约成本，反应体系可显著缩小。为了精确分装微量的试剂，准备足够多的

可用于几块板的主混合液是必要的。注意必须备有额外的反应液，用予弥补多图 4 添加海藻糖可提高PCR的效率。 E-gel上的黑色条带代表样本成功的PRC扩 增 ，透亮的孔为上样孔。 A12和 B12为阴性对照， M 栏为分子质量标准。 （ A) 没有 海藻糖的常规PCR主混合液， （ B) 含 5 % 海藻糖的PCR主混合液。 通道移液器吸液液量误差（ 例如进行10块 ％ 孔 板 的 12. 5 反应体系实验， 须备有多余的40个反应体系的反应液)。 15•通过加入扩增反应的促进剂如海藻糖、牛血清白蛋白、甜菜碱、二甲基亚砜可 消除 P C R 反应抑制剂的影响（28, 30, 31)。 16. 现已有越来越多不同种类的P C R 聚合酶及其反应预混合液产品。 一 些可让 P C R 反应更迅速（ 如 Z T a q ， Takara Bio, Otsu, Japan); 其他一■些则有助于 扩增有损坏的模板或提高扩增反应的保真性。 17. D N A 的使用量依赖于标本的类型和抽提方法。虽然使用量可能会有差异，但 是对基因组D N A 的定量通常不是必需的。因为低至几个拷贝的靶基因对P C R 扩增来说已足够。加 入 D N A 模板量越少越好，以避免有可能存在于D N A 样 品中的反应抑制剂及非特异的扩增。 18•通常反应应包含无扩増模板的阴性对照，测试试剂有无污染。同时还需包括用 已扩增过的D N A 样品作阳性对照用于测试P C R 试剂的有效性。 19. 最新一代的热循环仪（ 如 Eppendorf的 MasterCycler EP Silver) 具有更快的升 降温速度可使PCR反 应 更 迅 速 （1〜2h 相 对 于 3〜4 h)。 2 0 . 当使用新的引物时，一般 只 需 要 改 变 PCR 反应的复性温度。一 般的原则是将 复性温度设置为低于引物熔链温度2〜6°C 。 21. Invitrogen的 E-gel % 系统具有快速、灵敏、均一的特点并缩短了暴露于E B 的时间。 •资金消耗较少，胶的价格适中，操作耗时较少。 Bio-R a d 和 A m e r - sham Bioscience有相似的产品。 22. 对 于 700 b p 的扩增子，只需花6 m i n 就可充分分辨该条带。 23. 合并有E -gel图像的实验室电子记录本利于筛选成功的P C R 反应。这是一项耗 时的工作；如有可能使用自动分液系统。 24. 通常通过除去游离的核苷酸和剩余的引物来纯化P C R 产物。如果省略掉纯化 步骤，则在测序时导致开始的20〜50 b p 测序结果不好。当 P C R 产物进行双向 测序时这种影响不大。而当产物仅仅单向测序时，可选用多种操作方法（ 如乙

醇沉淀）和大量的试剂盒如 Multiscreen Filter technology(Millipore)。 •为降低成本，测序反应可缩减至10 进行，其 中 BigDye染料仅用0.25 p L (原有浓度的1/16)。因为BigDye染料是条形码实验操作中最昂贵的试剂，减 少它的使用量对降低成本至关重要。 . 测序反应试剂可以混合于9 6 孔板中，也可以预先混合于大容量试管中，可冻 存于一20°C 3 个月。加入海藻糖确保酶在反复冻融过程中的稳定性。 . BigDye V.3.I. cycle sequencing chemistry 提供了强大的测序平台，可高质量 测序至750 b p，甚至可准确测定局G C 含量的模板。 A m e r s h a m Bioscience提 供了另一种高可信度的方法，其 D Y E n a m i c E T Terminator cycle sequencing 试 剂盒可完全兼容于Applied Biosystem的仪器。 P C R 模板的加入体积应根据P C R 产物检测胶上的条带亮度来调整。 . 复性温度根据引物的特异性而不同，但是对大部分的C O I 条形码测序反应来 说 ， 55°C 都较为合适。 •许多高通量的基因组学研究装置使用乙醇沉淀或磁珠分离纯化测序反应。基于 固相可逆的固定方法（ solid-phase reversible immobilization， SPRI) 特别适用 于进行高通量条形码实验的实验室。 Applied B i o s ystem多 通 道 毛 细 管 电 泳 测 序 仪 包 括 3100、 3130、 3 7 3 0 和 3730X L ，分别对应于 4、 16、 48、 96 个通道。同样， A m e r s h a m Bioscience 的 测序仪产品包括M e g a B A S E 500、 1000和 4000,对 应 于 48、 96、 384个毛细管 电泳通道。

 

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