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DNA实验

Southern杂交一般操作

2024-09-29 DNA实验 加入收藏
Southern杂交一般操作关键词: Southern 杂交 操作步骤来源: 互联网一、 基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入:25 μl DNA样

Southern杂交一般操作

关键词: Southern 杂交 操作步骤来源: 互联网

一、 基因组酶切和电泳

在200 μl 微量离心管中加入:25 μl DNA样品(约10μg);3μl 限制性内切酶(MBI,10 U/ μl);5 μl 相应的10×buffer;补水到50μl。

然后加一滴矿物油覆盖,稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后,取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分,灌制0.8%的agrose胶,加入上样buffer后,在25―30V稳压电泳12―16hrs。

注意:在southern杂交中对,DNA的质量要求较高,否则酶切不完全导致失败。

二 转膜

1. 用0.2MHCl 脱嘌呤处理,偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色,大约需要15~30分钟。然后用水漂洗凝胶2~3次,将水倒尽,加入碱变性液,偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色(大约需要20~30分钟)。

注意:此方法对酶切后目标片段大于15kb时用,如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理,否则容易将片段打断,导致转膜后结合不紧密。

2. 取一磁盘架上一洗净玻璃板,在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液,在玻璃板上架两层长滤纸(30cm左右)(注意不要产生气泡)搭成盐桥。(滤纸比胶弱宽)依胶大小裁好尼龙膜,写好标记,正面向下,紧贴于胶上,防止有气泡产生,接这压两张同样大小的滤纸,不可过大以免短路,胶周围用X光片压条。胶应反面朝上因为 DNA多在胶的底层。堆积吸水纸。上面放一小玻板,板上加一500 g左右的重物。

注意:防止短路

3 转膜16---20hrs后,将尼龙膜取下,胶染色,观察转膜效果。将膜用2xSSC浸泡20分钟,滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs(80℃)。待用。

三、 杂交

1. 杂交炉与杂交管预热至65℃

2. 尼龙膜用2×SSC浸泡

3. 配置杂交液

4. ssDNA沸水变性10min,冰浴10min,置冰浴备用

Components Volume (ml) Note:ddH2O 20.7;50×Denhardts 0.6;P/H stock 8.1;20% SDS (OR 10% SDS) 0.3 (OR 0.6) ;Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热。

5. Add prepared ssDNA (10mg/L) ≥0.3 ml

6. 倒入杂交液,加入尼龙膜,65℃预杂交4~5小时(新膜)

注意:赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管,并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡,最后加入杂交液,盖好管盖。

四 、探针标记(for1~2 blots)

ddH2O 7 ml;Marker 1.5 ml;模板DNA 2 ml (about 100 ng);沸水变性8min,冰浴10min,瞬时离心。Add Buffer+Primer 7.5 ml;Add dNTPs(-dCTP) 3 ml;Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml);瞬时离心。Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot) ;37℃ 水浴≥4小时。

五、杂交

向标记探针的离心管中,Add 等体积TE 25 ml。Add 10×体积变性剂(杂交液) 250 ml。沸水变性10min,冰浴10min,将变性好的探针加入到杂交液中,混匀,65℃杂交过夜(12~16小时)。

六、洗膜

1. 2×SSC,0.5%SDS 5min;2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT);3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)。(洗膜过程中不断检测放射性强度直至200~500)。

滤纸吸干洗液,保鲜膜包好,暗室中压片,根据放射性强度暴光若干天。

冲洗X光片。

说明:

由于做southern的整个过程比较复杂涉及到的试剂也比较多,我这里仅做了个简要的叙述,但基本的实验过程已列举出来了,此过程中的试剂可以根据具体的实验要求适当调整,如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具体的介绍,请与我联系,我们共同讨论学习,另外,做杂交的过程中一定要注意防止同位素泄漏,做好个人的防护工作。


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