氢盐预处理法检测DNA片段甲基化

1. 基化特异性PCR。

甲基化特异性PCR(MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法。该法是将DNA经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。

在PCR反应时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。

两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高，甲基化DNA检出率越高。

该法不足之处在于：引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全，也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判断。

2. 性高效液相色谱法。

Oefner等提出变性高效液相层析(denaturing HPLC，DHPLC)用于单核苷酸和DNA分析。

邓大君等将该法改进并与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的DNA产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留，因此在随后的PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出PCR产物的DNA序列甲基化状况。

3. 合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。

联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法原理=先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后，PCR扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含CG序列，如BstUI(CGCG)。

若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割；若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。

这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和Agilent 2100 Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析，使COBRA的定量更快速，准确且无放射性污染。

该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究：需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR的使用，序列分析受到限制。

4. 基化敏感的单核苷酸引物延伸法。

甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(Ms-SNuPE)可用于快速判断DNA片段中某些具体位点的甲基化状况。其原理：样本DNA经亚硫酸氢钠修饰，PCR扩增目的片段，产物电泳分离后作为Ms-SNuPE模板。分别针对所检测的CpG位点设计上游引物，使3’-端引物紧邻C。

然后将模板、引物、Taq酶及32p标记的dNTP混合，进行单核苷酸延伸反应。若所检测的CpG位点发生甲基化，则32p标记的C掺入到PCR产物中；反之，未甲基化掺入的则为T。再电泳分离产物，成像。根据某- CpG位点的C/T信号强度比，可定量其甲基化程度。

也可不经电泳，PCR产物直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个CpG位点的平均甲基化程度。Ms-SNuPE可快速定量多个CpG位点的甲基化程度，但它不能对较长的序列进行全面的考察，且检测多个CpG位点时，需设计较多的引物。